Saponinas triterpênicas incluem uma ampla variedade de moléculas com diversas aplicações farmacológicas. As saponinas das folhas de Quillaja brasiliensis, espécie nativa do Sul do Brasil, são estrutural e funcionalmente semelhantes às encontradas nas cascas da espécie chilena Quillaja saponaria, as quais são utilizadas atualmente como adjuvantes em formulações comerciais de vacinas. O perfil de acúmulo da fração imunoadjuvante de saponinas triterpênicas de Q. brasiliensis (QB-90) foi avaliado em resposta a diferentes fatores de estresse. O conteúdo de QB-90 em discos foliares aumentou significativamente com a aplicação de diferentes agentes de estresse osmótico. Também pôde ser observado aumento nos teores de saponinas pela exposição de discos foliares a ácido salicílico, ácido jasmônico, ultrassom e luz ultravioleta C. Experimentos com plântulas indicaram um aumento significativo nos teores de QB-90 com o aumento moderado de irradiância luminosa e pela aplicação de dano mecânico nas folhas. Os resultados obtidos apoiam o papel de defesa induzida que estes metabólitos apresentam in planta. Com o objetivo de avançar os estudos de atividade adjuvante de Q. brasiliensis e ampliar a extensão de antígenos testados, uma vacina contra poliovírus foi avaliada em camundongos. Resultados demonstraram que as formulações de vacinas contendo saponinas da espécie brasileira aumentaram níveis de anticorpos específicos IgG, IgG1 e IgG2a, sugerindo um estímulo de ambos tipos de resposta imune (Th1 e Th2). A resposta celular foi confirmada por ensaios de DTH e pela avaliação dos níveis de mRNA das citocinas IL-2 e IFN- em esplenócitos murinos. A resposta imune de mucosas foi demonstrada pelos aumentos nos níveis de IgA em bile, fezes e lavados vaginais. O segundo objeto de estudo desta Tese é a espécie Centella asiatica (L.) Urban, que também apresenta saponinas triterpênicas bioativas em suas partes aéreas. Uma enzima responsável pela glicosilação de ácido asiático e ácido madecássico foi parcialmente purificada. Usando técnicas de proteômica e dados de sequências de cDNA, a sequência completa do clone que codifica uma glicosiltransferase foi obtida. O produto gênico recombinante, UGT73AD1, foi funcionalmente expresso em Escherichia coli, purificado por cromatografia de afinidade por metal imobilizado e funcionalmente caracterizado. UGT73AD1 foi identificada como sendo uma glicosiltransferase triterpênica de ácidos carboxílicos, provavelmente envolvida na biossíntese de monodesmosídeos da espécie. / Triterpene saponins include a large variety of molecules that find several applications in pharmacology. The saponins from leaves of Quillaja brasiliensis, a native species from Southern Brazil, show structural and functional similarities to those of Quillaja saponaria barks, which are currently used as adjuvants in vaccine formulations. The accumulation patterns of an immunoadjuvant fraction of leaf triterpene saponins (QB-90) in response to stress factors were examined. The content of QB-90 in leaf disks was significantly increased by application of different osmotic stress agents. Higher yields of bioactive saponins were also observed upon exposure to salicylic acid, jasmonic acid, ultrasound and UV-C light. Experiments with shoots indicated a significant increase in QB-90 yields with moderate increases in white light irradiance and by mechanical damage applied to leaves. These results support a general induced defense role for these metabolites in planta. Aiming at advancing the studies of Q. brasiliensis adjuvant activity and amplifying the range of antigens tested, an inactivated virus-based vaccine against poliovirus was evaluated in mice. Results demonstrated that saponin formulations were able to enhance poliovirus- specific total IgG, IgG1 and IgG2a, suggesting stimulation of both Th1 and Th2 immune responses. Cellular response stimulation was confirmed by DTH assays and by evaluating the enhancement of IL-2 and IFN-γ cytokine mRNA expression in mice splenocytes. Mucosal immune responses demonstrated that the QB-90-adjuvanted vaccine enhanced IgA titers in bile, feces and vaginal washings. Centella asiatica (L.) Urban, a species accumulating triterpene bioactive saponins in its shoots, was also subject of study in this Thesis. An enzyme capable of glucosylating asiatic and madecassic acids was partially purified. Using proteomic methods and cDNA sequence data, a full-length cDNA clone encoding the glucosyltransferase was obtained. The recombinant gene product, UGT73AD1, was functionally expressed in Escherichia coli, purified by immobilized metal-affinity chromatography and functionally characterized. UGT73AD1 was identified as a triterpene carboxylic acid glucosyltransferase, likely involved in monodesmoside biosynthesis in C. asiatica.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:lume.ufrgs.br:10183/106409 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Costa, Fernanda de |
| Contributors | Fett Neto, Arthur Germano, Gosmann, Grace |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | English |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS, instname:Universidade Federal do Rio Grande do Sul, instacron:UFRGS |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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