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Previous issue date: 2015-10-29 / CAPEs / Com o objetivo de criar um modelo biológico reprodutível e eficiente que possa mimetizar a interação proteína-carboidrato, nós reportamos o uso do ensaio quimiluminescente com lectinas conjugadas a éster de acridina (EA) para investigar a complexação da lectina ao carboidrato e para avaliação quantitativa da expressão de carboidratos em tumores cutâneos. Polissacarídeos de N-acetil-D-glicosamina (quitosana), glicose (phytagel) e galactose (carragenana) foram utilizados para sintetizar membranas (0,0314 – 0,6358 cm2). Concanavalina A-EA (Con A), Wheat germ aglutinina (WGA), Peanut aglutinina (PNA), Ulex europeaus aglutinina-I (UEA-I) e Maackia amurensis aglutinina (MAA) foram conjugadas a EA. A atividade hemaglutinante das lectinas-EA foi avaliada e a quimiluminescência quantificada e expressa em Unidades Relativas de Luz (URL). Biópsias de pele normal e de tumores cutâneos, tais como ceratose actínica (AK), ceratoacantoma (KA), carcinoma espinocelular (CEC) e basocelular (CBC), e as membranas foram incubadas com o conjugado lectina-EA (100 μL 100 μg mL-1) por 2h a 4°C. A emissão de fótons foi quantificada e correlacionada com a marcação de tecidos normais, transformados e das membranas. Inibições com carboidratos específicos foram realizadas. AK, KA , CBC e CEC apresentaram menor expressão de α -D- glucose/manose e resíduos de α-L-fucose, em comparação com o tecido normal. Os tumores cutâneos apresentaram maior expressão resíduos de β Gal-(1-3)-GalNAc que o tecido normal . AK e SCC exibiram maior expressão de resíduos Neu5Ac-α(2,3)Gal que a epiderme normal. KA e BCC apresentaram valores de URL equivalentes, em comparação com o tecido normal. Os valores de URL diminuíram quando as lectinas foram incubadas com seus carboidratos específicos. Os valores das constantes e os sítios de ligação foram calculados para cada lectina utilizando a equação obtida a partir das curvas hiperbólicas, 2,4 x 10-7 M-1 ± 0,8 x 10-7 M-1and 1,3 x 10-3 mol . mg-1 ± 0,3 x 10-3 mol . mg-1 (Con A); 0,9 x 10-6 M-1 0,4 x 10-6 M-1 and 0,021 x 10-3 mol . mg-1 ± 0,003 x 10-3 mol . mg-1 (WGA) and 2,0 x 10-6 M-1 0,9 x 10-6 M-1 and 0,069 x 10-3 mol . mg-1 ± 0,010 x 10-3 mol . mg-1 (PNA). O método quimiluminescente permitiu a avaliação quantitativa direta da expressão de carboidratos em neoplasias de pele e a investigação a complexação da lectina ao carboidrato através do modelo de Langmuir, combinando a especificidade desta interação e a sensibilidade dos ensaios quimiluminescentes. / Aiming to create a reproducible and efficient biological model that mimic the protein-carbohydrate interaction, we report the use of chemiluminescent assay with lectins labeled to acridinium ester (AE) to investigate the complexation of lectin to carbohydrate and for the quantitative evaluation of carbohydrates expression in cutaneous tumors. Polysaccharides made N-acetyl-D-glucosamine (chitosan), glucose (phytagel) and galactose (carrageenan) were used to synthetize membranes (0,0314 – 0,6358 cm2). Concanavalin A-AE (Con A), Wheat germ agglutinin (WGA), Peanut agglutinin (PNA), Ulex europeaus agglutinin-I (UEA-I) e Maackia amurensis agglutinin (MAA) were labeled to AE. The hemmagglutinating activity of lectins-AE was evaluated and the chemiluminescence was quantified and expressed in Relative Light Unit (RLU). Biopsies of normal skin and cutaneous tumors such as, actinic keratosis (AK), keratoacantoma (KA), squamous cell carcinoma (SCC) and basal cell carcinoma (BCC), and membranes were incubated with lectins-AE (100 μL 100 μg mL-1) for 2h at 4°C. Photon emission was measured and correlated to the labeling of the normal, transformed tissues and membranes. Inhibitions with specific carbohydrate were carried out. AK, KA, SCC and BCC showed lower expression of -D-glucose/mannose and -L-fucose residues compared to normal tissue. Cutaneous tumors displayed higher expression of Gal-(1-3)-GalNAc residues than normal tissue. AK and SCC exhibited higher expression ofNeu5Ac-(2,3)Gal residues than normal epidermis. KA and BCC showed equivalent RLU values compared to normal tissue. The RLU values decreased when the lectins were incubated with their specific carbohydrate. The constant values and maximum binding sites on the membranes were calculated for each lectin using the equation obtained from hyperbolic curves, 2.4 x 10-7 M-1 ± 0.8 x 10-7 M-1and 1.3 x 10-3 mol . mg-1 ± 0.3 x 10-3 mol . mg-1 (Con A); 0.9 x 10-6 M-1 0.4 x 10-6 M-1 and 0.021 x 10-3 mol . mg-1 ± 0.003 x 10-3 mol . mg-1 (WGA) and 2.0 x 10-6 M-1 0.9 x 10-6 M-1 and 0.069 x 10-3 mol . mg-1 ± 0.010 x 10-3 mol . mg-1 (PNA). The chemiluminescence method allowed quantitative assessment of the carbohydrate expression in cutaneous tissues and was an analytical technique efficient to investigate the complexation of lectin to carbohydrate through Langmuir model, combining the specifity this interaction and sensibility of chemiluminescent assays.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpe.br:123456789/17482 |
| Date | 29 October 2015 |
| Creators | LIMA, Luiza Rayanna Amorim de |
| Contributors | http://lattes.cnpq.br/6466300269003304, CARVALHO JÚNIOR, Luiz Bezerra de, BELTRÃO, Eduardo Isidoro Carneiro, TEIXEIRA, José António Couto |
| Publisher | Universidade Federal de Pernambuco, Programa de Pos Graduacao em Biologia Aplicada a Saude, UFPE, Brasil |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPE, instname:Universidade Federal de Pernambuco, instacron:UFPE |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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