Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1
DissCWR.pdf: 2377767 bytes, checksum: 22e5ef2553191133e9dfe9a15fc8707a (MD5)
Previous issue date: 2007-03-19 / Universidade Federal de Sao Carlos / Sugarcane is a plant of great economical importance, mainly in Brazil, which is
currently the largest producer of this crop in the world. However, sugarcane farming has
suffered attacks from pests and pathogens, leading to considerable economical losses.
Therefore, a number of studies have focused on the development of more resistant
sugarcane varieties. Our laboratory has been working on a sugarcane protein (CaneCPI-
1), which is a cystein-protease inhibitor protein. Based on studies that indicate that
insects belonging to the order Coleoptera possess cystein-proteases in their mid-gut and
with the knowledge that some species of Coleoptera are sugarcane pests, a transgenic
sugarcane plant overexpressing the CaneCPI-1 gene was developed under the control of
maize ubiquitin promoter. CaneCPI-1 was fused to a His-tag to facilitate further
purification through affinity chromatography. The calli transformation was performed
through biobalistics. The transformed plants were then selected by polymerase chain
reaction. Positive plants were further selected by Semi-quantitative PCR and Western
blotting. A transformed plant expressing a His-tagged CaneCPI-1 was selected for
purification of the recombinant protein in a nickel column, enabling purification of
HISCaneCPI-1 from plant leaves in a single step. The yield was about 6mg of pure
protein per kilogram of sugarcane leaves. The HISCaneCPI-1 purified from the
transformed sugarcane demonstrated inhibitory activity on the human cysteine protease
cathepsin L. These studies demonstrate that the sugarcane can be a safe and viable
expression system for recombinant protein production, and are the first step in the
establishment of a sugarcane plant that is more resistant to pathogens. / A cana-de-açúcar é uma planta de grande importância econômica, principalmente no
Brasil, que hoje é o maior produtor mundial desta cultura. Porém, as lavouras de canade-
açúcar estão cada vez mais sendo atacadas e destruídas por pragas e patógenos,
causando grandes perdas econômicas para os produtores. Assim, vários estudos estão
focados no desenvolvimento de variedades de cana-de-açúcar mais resistentes. Nosso
laboratório tem trabalhado com a proteína CaneCPI-1, uma proteína inibidora de
cisteíno-protease. Baseado em estudos que indicam que insetos pertencentes à ordem
Coleoptera possuem enzimas proteolíticas do tipo cisteíno-proteases em seu trato
digestivo e, sabendo que algumas espécies de Coleoptera são pragas de cana-de-açúcar
e que causam sérios danos aos canaviais, foi desenvolvida uma cana-de-açúcar
transgênica superexpressando o gene da CaneCPI-1 sobre controle do promotor da
ubiquitina do milho. A CaneCPI-1 foi também fusionada a uma his-tag para facilitar a
posterior purificação por cromatografia de afinidade em coluna de níquel. Para a
transformação genética dos calos foi utilizado o método de biobalística e, após isto, foi
feita uma seleção das plantas transformadas através de uma reação de PCR. As plantas
que apresentaram resultado positivo foram selecionadas por PCR Semi-quantitativo e
ensaios de Western blotting. Uma planta transformada expressando a proteína CaneCPI-
1 com his-tag foi selecionada para a purificação da proteína recombinante em coluna de
afinidade ao níquel, possibilitando a purificação da HISCaneCPI-1 em um único passo. O
rendimento foi de 6mg de proteína pura por kilograma de folhas de cana-de-açúcar. A
HISCaneCPI-1 purificada demonstrou atividade inibitória contra a enzima catepsina L,
uma cisteíno-protease humana. Estes resultados mostram que a cana-de-açúcar pode ser
usada como um sistema de expressão seguro e viável para a produção de proteínas
recombinantes e é o primeiro passo para o estabelecimento de uma cana-de-açúcar
resistente à pragas.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufscar.br:ufscar/5441 |
| Date | 19 March 2007 |
| Creators | Ribeiro, Carolina Werner |
| Contributors | Silva, Flávio Henrique da |
| Publisher | Universidade Federal de São Carlos, Programa de Pós-graduação em Genética Evolutiva e Biologia Molecular, UFSCar, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSCAR, instname:Universidade Federal de São Carlos, instacron:UFSCAR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0057 seconds