Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2014. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2014-08-12T13:44:06Z
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2014_GiseleSoaresAnastacio.pdf: 1840535 bytes, checksum: 2912497e9fbaf7e46fa3f7c467f17b62 (MD5) / Quimosina, é uma aspartil protease utilizada como coagulante do leite na indústria de fabricação de queijo. Tradicionalmente, a quimosina é extraída a partir do abomaso de bezerro lactantes. Com o aumento da demanda desta enzima, as fábricas de queijos foram buscar outras fontes alternativas de baixo custo, entre elas a quimosina recombinante que surgiu como uma opção promissora. Neste trabalho, os cDNA de quimosina bovina e de camelo foram clonados em vetores de Pichia pastoris para a expressão constitutiva de elevado nível, sob o controle do promotor endógeno PPGK1. Os vetores foram integrados no genoma da levedura para expressão estável. Após crescimento, os sobrenadantes foram recolhidos e ambas as proteínas recombinantes foram purificadas num único passo de cromatografia com uma coluna de exclusão molecular (Sephacryl S-100) antes de caracterização enzimática. As quimosinas recombinantes apresentaram uma massa molecular entre 35 e 45 kDa. Quimosina bovina purificada exibiu uma atividade enzimática de cinco vezes superior a quimosina de camelo nas mesmas condições padrão. Ambas quimosinas apresentaram um pH ótimo de aproximadamente 4,0 e a temperatura ótima entre 55 e 60 °C. O efeito dos íons sobre a atividade das proteínas também foi estudado: maior atividade com Ca+2 foi observado entre 40-140 mM e o íon Mg+2 favoreceu um aumento da atividade enzimática de ~100% (bovina) e 66% (camelo), quando comparado com o íon Ca+2. Testes de especificidade de substrato revelaram que ambas as enzimas mostraram uma maior afinidade para k-caseína do que para α e β-caseína. Juntos, os resultados apresentados neste trabalho mostram que a quimosina bovina produzida por P. pastoris é uma fonte recombinante mais atraente do que a quimosina camelo para a fabricação de queijo. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Chymosin is an aspartic protease used as a milk coagulant in the cheese making industry. Tradicionally, chymosin is extracted from the abomasum of suckling calves. With the increasing demand for this enzyme, cheese manufactures seek other low cost alternative sources, among them recombinant chymosin has emerged as a promising option. In this work, bovine and camel chymosin cDNAs were cloned into a Pichia pastoris vectors for high level constitutive expression under the control of endogenous PPGK1 promoter. The vectors were integrated into the P. pastoris genome for stable expression. After growth, supernatants were collected and both recombinant proteins were purified in a single chromatographic step with an exclusion molecular column (Sephacryl S-100) prior to enzyme characterization. Recombinant chymosins showed a molecular mass between 35 kDa and 45 kDa. Purified bovine chymosin showed an enzymatic activity five times higher than camel chymosin under the same standard conditions. Both chymosins showed optimum pH around 4.0 and optimum temperature between 55 and 60°C. The effect of ions on protein activity was also studied: highest activity with Ca2+ was observed between 40-140 mM and Mg2+ favored an increase of enzyme activity of ~ 100% (bovine) and 66% (camel) when compared to Ca2+. Substrate specificity tests revealed that both enzymes showed a higher affinity for k-casein over the α and β-casein counterparts. Together, the results presented in this work show that bovine chymosin produced in P. pastoris is a more attractive recombinant source than camel chymosin for cheese manufacturing.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/16084 |
| Date | 23 May 2014 |
| Creators | Anastácio, Gisele Soares |
| Contributors | Parachin, Nádia Skorupa, De Marco, Janice Lisboa |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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