Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2015-12-21T13:54:05Z
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2015_KarenOfujiOsiro.pdf: 2867423 bytes, checksum: 9d23fe29816120dc28d973b7de26c02f (MD5) / O presente trabalho tem como propósito a purificação de celulossomas, sua caracterização e do secretoma de um novo isolado de Clostridium thermocellum B8, obtido do rúmen de caprino. Para obtenção das amostras proteicas C. thermocellum foi cultivada em meio líquido contendo celulose como fonte de carbono. O secretoma que constitui a amostra de Proteínas Ligadas á Celulose (PLC) foi eluído a partir da celulose residual da cultura. As frações cromatográficas do principal pico de proteína resultante do fracionamento da amostra PLC em uma cromatografia de exclusão molecular (Superdex S-200) compõe a amostra de Celulossomas Parcialmente Purificados (CPP). Ambas as amostras apresentaram atividades enzimáticas celulolíticas e xilanolíticas. As análises de SDS-PAGE, DLS e espectrometria de massa confirmaram que a amostra CPP se trata de um complexo celulossomal, com uma massa molecular estimada de 11,3 MDa ± 4,4 MDa. As proteínas constituintes de CPP foram identificadas por espectrometria de massa LC-MS/MS, levando a identificação de: proteína estrutural (CipA), glicosil hidrolases das famílias 5, 8, 9, 10 e 48 e transportadores do tipo ABC. Na amostra PLC foram identificadas principalmente proteínas envolvidas no catabolismo de polissacarídeos, além de proteínas relacionadas com o mecanismo de transporte de moléculas e processos metabólicos. Dentre as proteínas que têm a função no catabolismo de polissacarídeos, foram identificados glicosil hidrolases das famílias 5, 8, 9, 10, 11, 26, 30, 43 e 53, com atividades de endoglucanase, celobiohidrolases, endoxilanases, endoxilanases com esterase feruloil e acetil com função de xilana esterase, xiloglucanases, arabinoxilanase, glucoxilana xilanahidrolase, arabinofuranosidase, exogalactanase, endogalactanase (arabinogalactana), quitinase, mananase. CPP e PLC apresentaram atividade máxima no intervalo de temperatura entre 60°C-70°C, pH 5.0, e estabilidade térmica a 50, 60 e 70°C, principalmente, no que diz respeito a amostra de PLC. As atividades holocelulolíticas de PLC foram inibidas por compostos fenólicos, enquanto que CPP apresentou um aumento nas atividades de CMCase e xilanase na presença de vários fenóis. A partir dos resultados da sacarificação dos substratos de celulose, palha de cana e piolho de algodão por PLC e CPP, foi observado maiores quantidades de açúcares liberados principalmente a 50°C, em comparação com os dados de 60°C, após 10 dias de incubação. Entretanto, foi observado que após o segundo dia de sacarificação, que os produtos obtidos pela desconstrução de materiais lignocelulósicos, acabam por interferir na velocidade de hidrólise das enzimas de C. thermocellum B8. Em conclusão, este estudo demonstrou potencial para utilização de ambas as amostras (CPP e PLC) de C. thermocellum B8 para hidrolisar biomassas lignocelulósicas, destacando-se o aumento da atividade celulolítica e xilanolítica de CPP na presença de compostos fenólicos, além da termoestabilidade de PLC. ____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The present work aimed the purification and characterization of the secretome produced by Clostridium thermocellum B8, a novel isolate obtained from goat rumen, after growth on liquid medium containing cellulose as carbon source. The secretome were eluted from the residual substrate, constituting the Protein Linked on Cellulose (PLC) sample. The main protein peak of PLC fractionation onto a molecular exclusion (Superdex S-200) composes the Cellulosomes Partially Purified (CPP) sample. Both samples presented enzymatic activities of cellulases and xylanases. It was elucidated through SDS-PAGE, DLS and mass spectrometry that CPP sample is a cellulosome complex, with an estimated mass of 11,3 MDa ± 4,4 MDa. CPP’s constituting proteins were identified by mass spectrometry LC-MS/MS leading the identification of: scaffolding protein (CipA), glycoside hydrolase proteins classified on the families 5, 8, 9, 10 and 48 and ABC transporter substrate-binding protein. In the PLC sample were identified mostly proteins involved in the catabolism of polysaccharides, besides proteins related to the transport mechanism molecules and metabolic processes. Among the proteins which have catabolism of polysaccharides function, were identified glycosyl hydrolase families 5, 8, 9, 10, 11, 26, 30, 43 and 53 with endoglucanase activity, cellobiohydrolases, endoxylanases, endoxylanases with feruloil esterase and acetyl xylan esterase function, xyloglucanases, arabinoxylanase, glucoxylana xylanhydrolase, arabinofuranosidase, exogalactanase, endogalactanase (arabinogalactan), chitinase, mannanase. CPP and PLC presented maximal activity in the range of 60° to 70°C and pH 5.0, and also those samples have a high thermostability at 50, 60 and 70°C mainly for PLC sample. PLC holocelullolytic activities were inhibited by phenolic compounds, while CPP showed improvement or was less inhibited on its xylanase and CMCase activity in phenols presence. Saccharification results of cellulose, sugarcane straw and cotton gin waste by PLC and CPP, showed highest amounts of sugar released mostly at 50°C in comparison to 60°C and after 10 days of incubation. In summary, this research demonstrated the potential of using CPP and PLC samples of C. thermocellum B8 to hydrolyze lignocellulosic biomasses, with the ability of CPP increase its holocelullolytic activities in the presence of phenolic compounds, and the interesting thermostability of PLC sample, both being valuable for second generation production of biofuels.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/19317 |
| Date | 23 April 2015 |
| Creators | Osiro, Karen Ofuji |
| Contributors | Noronha, Eliane Ferreira |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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