Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Botânica, Programa de Pós-Graduação em Botânica, 2016. / Texto liberado parcialmente pelo autor. Conteúdo restrito: Capítulos 1, 2 e 3. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-07-26T15:43:33Z
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2016_JaquelineMartinsVasconcelos_Parcial.pdf: 745494 bytes, checksum: b3e0c6289918a1d03a8fe366ff6ff98d (MD5) / O presente trabalho teve por objetivo caracterizar bioquímica e histoquimicamente a germinação, desenvolver estratégias para a conservação de germoplasma, bem como induzir e caracterizar a calogênese in vitro de pinhão-manso visando o desenvolvimento de protocolos para a embriogênese somática. Para os estudos de germinação, as sementes foram desinfestadas, inoculadas in vitro e mantidas na presença de luz. As avaliações de desenvolvimento e as coletas para as análises morfoanatomicas, histoquímicas e bioquímicas da germinação foram realizadas ao longo do período de cultivo de 30 dias. A caracterização anatômica foi realizada com o auxílio do corante Azul de Toluidina e para as análises histoquímicas foram utilizados Sudan IV, para compostos lipídicos, Xylidine Ponceau, para proteínas totais e Reagente de Schiff/ ácido periódico – PAS, para polissacarídeos neutros. Para as análises bioquímicas, os materiais oriundos dos diferentes períodos de germinação foram avaliados quanto a percentagem de açucares solúveis totais (AST) e amido via método colorimétrico, de proteínas em aparelho CNS, além da quantificação de lipídios via técnica de derivatização in situ em GC-MS. Anatomicamente, as sementes apresentaram endosperma com células isodiamétricas, paredes delgadas e conteúdo celular visível em formas de gotas de lipídeos e corpos proteicos; os cotilédones e folhas com epiderme simples e mesofilo composto por parênquima paliçádico e lacunoso e o hipocótilo com cilindro vascular do tipo eustelo. Histoquimicamente, evidenciou-se que os lipídeos e as proteínas aparecem como o principal material de reserva no endosperma. As análises bioquímicas confirmaram a maior presença de ácidos graxos em relação aos demais compostos de reserva no endosperma, principalmente os ácidos oleicos e linoleicos. Já com a formação da plantula, o amido apareceu como a principal composto de reserva. Para os estudos de conservação, verificou-se a umidade inicial das sementes e, em seguida, se realizou o processo de dessecação em sílica-gel por 0, 24, 48, 96 e 192 horas. Após cada tempo de dessecação, a umidade foi novamente avaliada e as sementes armazenadas em diferentes condições de temperatura (25ºC, 6ºC, -20ºC e -196°C) por 0, 180, 360 e 720 dias. Transcorrido o tempo de conservação, as sementes foram germinadas in vitro e a germinação avaliada após 30 dias de cultivo. Análises de condutividade elétrica foram realizadas nas sementes armazenadas em todos os tratamentos. Para a criopreservação de eixos embrionários, inicialmente realizou-se a extração dos eixos em condições assépticas e a hidratação dos mesmos por 1 hora em placa de petri contendo papel filtro umedecido com água destilada estéril. Posteriormente, aplicou-se os tempos de dessecação pela exposição dos eixos ao fluxo de ar da câmara de fluxo laminar por 0, 2, 4, 6, 8 e 10 horas. Logo após os tempos de dessecação, a umidade dos eixos embrionários foi aferida e estes foram imersos em nitrogênio líquido por 0, 2, 30, 90, 180 e 360 dias. Após o período de conservação, foi realizado o teste de germinação in vitro, com avaliação após 30 dias de cultivo. As sementes de pinhão-manso toleraram a dessecação e se mantiveram viáveis com até 4,3% de umidade. Porém, não toleraram o armazenamento por período de até 720 dias em todas as temperaturas avaliadas, o que sugere um comportamento intermediário das sementes. O teste de condutividade elétrica foi eficaz na avaliação da qualidade das sementes, apresentando alta correlação entre a quantidade de íons observados e a percentagem de germinação. Com relação a criopreservação dos eixos embrionários, verificou-se uma taxa média de 90% de germinação, após 360 dias de armazenamento, quando estes apresentavam umidade em torno de 8%, e foi considerado a melhor técnica de conservação a longo prazo desta espécie. Por fim, explantes de hipocótilo e folhas cotiledonares de plantas cultivadas in vitro foram induzidos a calogênese em meio de MS suplementado com 2,4-D e picloram (0, 50, 100, 200 e 400 μM) em combinação ou não com 50 μM de cinetina, sendo mantidos em condição de luz ou escuro por 30 e 60 dias. Após os tempos foi avaliado a percentagem de formação de calos, textura dos calos (friável, semicompacto e compacto), além da coloração predominante. Amostras de calos com 60 dias de cultivo foram incluídas em metacrilato e caracterizados anatomicamente. Explantes de pinhãomanso, constituídos por hipocótilo e folhas cotiledonares foram responsivos a indução de calos, apresentando 100% de explantes com calos em vários tratamentos, principalmente na presença de picloram. O tratamento contento apenas cinetina promoveu a formação de calos friáveis em folhas cotiledonares e calos friáveis e semi-compactos em explantes de hipocótilo. O 2,4-D foi mais eficiente na formação de calos compactos com aspecto globular, enquanto o picloram induziu de calos semi-compactos e friáveis e de grande volume. Calos embriogênicos foram observados em hipocótilos e folhas cotiledonares cultivados com 200 e 400 μM de picloram e 2,4-D, preferencialmente, no escuro. O presente trabalho contribuiu com informações relevantes sobre a caracterização da germinação de sementes de pinhão-manso. Esclareceu e determinou a melhor técnica de conservação ex situ para a espécie, sugerindo a mudança da classificação das sementes de ortodoxas para intermediarias. E no estudo de calos, propiciou várias informações a respeito da calogênese em pinhão-manso que servirão de subsídios para futuros trabalhos de embriogênese somática para a espécie. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / This study aimed to characterize biochemical and histochemically germination, develop strategies for the conservation of germplasm, as well as induce and characterize the callus formation in vitro Jatropha for the development of protocols for somatic embryogenesis. For germination studies, the seeds were sterilized, inoculated in vitro and maintained in the presence of light. Development assessments and collections for morphoanatomic analysis, histochemical and biochemical germination were carried out during the 30-day culture period. The anatomical characterization was performed with the aid Blue stain and Toluidine for histochemical analyzes was used Sudan IV to lipid compounds, Xylidine ponceau to total protein and Schiff reagent / periodic acid - SAP for neutral polysaccharides. For the biochemical analyzes, the materials from the different periods of germination was evaluated as the percentage of total soluble sugars (AST) and starch via colorimetric method for proteins in the CNS device, and quantifying lipids via derivatization in situ GC MS. Anatomically, the seeds presented endosperm with isodiametrical cells, thin walls and visible mobile content forms droplets of lipid and protein bodies; cotyledons and leaves with simple epidermis and mesophyll consisting of palisade and spongy parenchyma and hypocotyl with vascular eustele type cylinder. Histochemically, it was shown that lipids and proteins appear as the main reserve material in the endosperm. Biochemical analyzes confirmed the increased presence of fatty acids in relation to other reserve compounds in the endosperm, especially oleic and linoleic acids. Since the formation of seedling, starch appeared as the primary reserve compound. For conservation studies, it was the initial seed moisture, and then held the desiccation process silica gel for 0, 24, 48, 96 and 192 hours. After each time of drying, the humidity was again evaluated and the seeds stored at different temperature conditions (25 ° C, 6 ° C, -20 ° C and - 196 ° C) for 0, 180, 360 and 720 days. Elapsed time of conservation, the seeds were germinated in vitro and germination evaluated after 30 days of cultivation. electrical conductivity analyzes were performed on seeds stored in all treatments. For cryopreservation embryonic axes initially held extracting the axles under aseptic conditions and hydration thereof for 1 hour in petri dishes containing filter paper moistened with sterile distilled water. Subsequently, he applied to the drying times for exposing the axes of airflow of the laminar flow chamber for 0, 2, 4, 6, 8 and 10 hours. Soon after the drying time, moisture from the embryonic axis was measured and these were immersed in liquid nitrogen for 0, 2, 30, 90, 180 and 360 days. After the retention period, in vitro germination test was performed, with evaluation after 30 days of cultivation. The Jatropha seeds tolerate desiccation and remained viable up to 4.3% moisture. However, they not tolerate storage for a period up to 720 days all temperatures measured, which suggests an intermediate behavior seeds. The electrical conductivity test was effective in assessing the quality of seeds, with high correlation between the amount of ions observed and the percentage of germination. Regarding the cryopreservation of embryonic axes, there was an average 90% germination, after 360 days of storage when they had moisture around 8%, and was considered the best long-term preservation technique of this kind. Finally, hypocotyl and cotyledon explants of leaves from plants grown in vitro were induced to callus induction on MS medium supplemented with 2,4-D and Picloram (0, 50, 100, 200 and 400 mM) in combination with or without 50 uM kinetin, being kept in light or dark condition for 30 and 60 days. After time was evaluated the percentage of callus formation, callus texture (crumbly, semi-compact and compact), and the predominant color. Samples of corns with 60 days of culture were included in methacrylate and characterized anatomically. Jatropha explant consisting of hypocotyl and cotyledons were responsive to callus induction, with 100% of explants with calluses on various treatments, especially in the presence of picloram. Treatment satisfaction only kinetin promoted the formation of friable callus in cotyledons and friable calluses and semi-compact in hypocotyl explants. The 2,4-D was more efficient in the formation of compact callus with a globular appearance as picloram induced semi-compact callus and friable and large volume. embryogenic calli were observed in hypocotyls and cotyledons cultured with 200 to 400 mM of picloram and 2,4-D, preferably in the dark. This work contributed with relevant information on the characterization of Jatropha seed germination. He clarified and determined the best ex situ conservation technique for the species, suggesting the change of the classification of orthodox seeds to intermediate. And the study of calluses, led various information about the callogenesis in Jatropha which will serve as subsidies for future work on somatic embryogenesis for the species.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/21420 |
| Date | 29 April 2016 |
| Creators | Vasconcelos, Jaqueline Martins |
| Contributors | Scherwinski-Pereira, Jonny Everson |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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