Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by wesley oliveira leite (leite.wesley@yahoo.com.br) on 2009-11-24T21:07:45Z
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Previous issue date: 2006 / O fator 1 induzível por hipóxia (HIF-1) é um regulador central da resposta à
mudanças na concentração de oxigênio e tem um papel importante nos processos
fisiológicos e patológicos em humanos. Este fator de transcrição é expresso quando
as células de mamíferos são submetidas à condições de hipóxia e ativa cerca de 70
genes alvos regulados por oxigênio. HIF-1 é uma proteína heterodimérica composta
por dois membros da família de proteínas contendo o domínio basic helix-loop-helix
(bHLH)-PER-ARNT-SIM (PAS), HIF-1α (atua unicamente na resposta à hipóxia) e o
HIF-1β (também conhecido como translocador nuclear do receptor de aril
hidrocarbono, ARNT, que é constitutivamente expresso). A estabilidade e a atividade
do HIF-1α são reguladas por modificações pós-traducionais, tais como fosforilação,
hidroxilação, nitrosilação e acetilação. Sob normóxia, HIF-1α é constitutivamente
expresso e subsequentemente hidroxilado pela HIF prolil hidroxilase (HPH) levandoo
a ser rapidamente marcado para a degradação mediada pelo proteasoma. A
seqüência de eventos que leva a ativação do HIF-1α e os efeitos paradoxais do HIF-
1 (efeitos pro- e anti-apoptóticos) não são completamente entendidos. Também não
estão claros como os mecanismos dependentes e independentes de oxigênio que
contribuem para as modificações pós-traducionais do HIF-1α, translocação nuclear,
heterodimerização com o ARNT, ligação ao DNA em regiões regulatórias cis de
genes alvos e recrutamento de cofatores. Portanto, as proteínas que interagem com
o HIF-1α e as modificações pós-traducionais precisam ser melhor entendidas.
Células de leveduras compartilham vários aspectos de sua bioquímica com os
organismos multicelulares tais como, respostas transcricionais e celulares e
mecanismos de modificações pós-traducionais de proteínas. Além disso, elas são
fáceis de manipular sob diferentes condições de laboratório. Este trabalho visou
avaliar a viabilidade da expressão do HIF-1 na levedura Saccharomyces cerevisiae
como um modelo alternativo de expressão. Em células de leveduras, HIF-1 não é
alvo de degradação sob condições de normóxia, já que esse microorganismo não
possui a via de degradação mediada pelo von Hippel Lindau (proteína supressora de
tumor). Pretendemos usar esse modelo de expressão para estudar as modificações
pós-traducionais do HIF-1α e sua interação com outras proteínas que possam afetar
sua dimerização/co-ativação, sob diversas condições. Estabelecemos então uma linhagem de levedura que expressa o HIF-1α e o ARNT constitutivamente sob
condições normais de oxigênio. Também mostramos que o HIF-1α recombinante
humano foi capaz de formar o heterodímero com o ARNT e se ligar ao elemento
responsivo a hipóxia (HRE) da eritropoietina humana. Além disso, nós descrevemos
a presença desse motivo no genoma de levedura e mostramos que esse organismo
pode conter motivos HRE funcionais. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) is a central regulator in the response to
changes in oxygen concentration and plays an important role in physiological and
pathological processes in humans. This transcription factor is expressed when
mammalian cells are subjected to hypoxia and activates transcription of over 70
oxygen-regulated target genes. HIF-1 is a heterodimeric protein composed of two
members of the basic helix-loop-helix (bHLH)-containing PER-ARNT-SIM (PAS)
domain family, HIF-1α (unique to the hypoxia response) and HIF-1β (also known as
the aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator, ARNT, which is constitutively
expressed). HIF-1α stability and activity are regulated by post-translational
modifications such as phosphorylation, hydroxylation, nitrosation and acetylation.
Under normoxia, HIF-1α is constitutively expressed and subsequently hydroxylated
by a HIF prolyl hydroxylase (HPH) causing it to be rapidly targeted for proteasomemediated
degradation. The sequence of events that leads to the full activation of HIF-
1α and the paradoxical effects of HIF-1 (pro- and anti-apoptotic effects) are not
completely understood. Neither is clear how oxygen-dependent nor oxygenindependent
mechanisms contribute to the post-translational modifications of HIF-1α,
nuclear translocation, heterodimerization with ARNT, DNA binding to the cisregulatory
region of target genes and recruitment of cofactors. Therefore, HIF-1α
interacting partners and the pos-translational modifications need to be better
elucidated. Yeast cells share several aspects of its biochemistry with multicellular
organism such as, transcriptional and cellular responses and mechanisms of protein
post-transcriptional modifications. In addition they are easy to manipulate under
different laboratory conditions. This work aimed to evaluate the viability of HIF-1
expression in the yeast Saccharomyces cerevisiae as an alternative expression
model. In yeast cells, HIF-1 may not be targeted to degradation under normoxic
conditions, since this microorganism lacks the pathway mediated by the von Hippel
Lindau-VHL (a tumor suppressor protein). We intend to used this expression model
to study the post-translational modifications and its interaction with other proteins that
may affect its dimerization/co-activation. We established a yeast strain overexpressing
HIF-1α and ARNT in a constitutive manner under normal conditions of
oxygen. We also showed that recombinant HIF-1α was able to form a heterodimer
with ARNT and bind to human erythropoietin hypoxia responsive element (HRE)
motif. Additionally, we described the presence of this motif in the yeast genome and
showed that this organism may harbor HRE motifs.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/2317 |
| Date | January 2006 |
| Creators | Ferreira, Túlio César |
| Contributors | Campos, Élida Geralda |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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