Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2018-03-01T17:02:44Z
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Previous issue date: 2018-03-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). / O presente estudo objetivou determinar o melhor sistema de cultivo individual a ser utilizado e a quantidade relativa de RNAm de genes candidatos à marcadores de competência em biópsias de células do cumulus (CC) imaturas e maturadas de ovócitos com alta e baixa capacidade de produzir embriões in vitro. Foram realizados dois experimentos, sendo que no primeiro foram testados o efeito de dois tipos de cultivo individual (microgotas 20 μL e Cell Tak) na produção de embriões, o uso de ácido fólico como antioxidante em diferentes concentrações (0, 10, 20, 50 e 500 μM) na produção embrionária e no padrão de metilação de regiões do α- satélite e IGF2 e, o uso de ácido fólico isolado ou conjugado com ITS durante o cultivo em sistema individual na produção e qualidade dos embriões. Já no segundo foi determinada a quantidade relativa de RNAm para os genes GPC4, PTGS2, LUM, ALCAM, FSHR, PGR, GPX3, SERPINE2, HAS2, PRDX3, por PCR em tempo-real (qPCR) em biópsias de CC imaturas e maturadas. As biópsias utilizadas para o qPCR foram agrupadas conforme o resultado da produção de embriões em: CCOs que formaram blastocisto em D7(embrião); CCOs que não clivaram (não clivado) e, CCOs que clivaram, mas que não chegaram a blastocisto (clivado). No primeiro experimento, foi observado que o grupo Cell Tak apresentou menor taxa de clivagem (P≤0,05) e menor produção de embriões (P≤0,05) em D7 e D8 em relação ao grupo controle e microgotas de 20 μL. Em relação às diferentes concentrações de ácido fólico, o grupo 500μM apresentou uma redução nas taxas de clivagem em D6 (P≤0,05) em relação aos demais. Em D7, não houve diferença entre os grupos quando comparados ao grupo controle. Em relação a metilação da região α- Satélite, os grupos Controle, 20 μM e 500 μM apresentaram padrão semelhantes (P>0,05), que era hipometilado. Já para a região do éxon 10 do gene IGF2, o padrão de metilação foi diferente nos grupos 20 μM e 500 μM em relação ao controle (P ≤0,05). Quanto ao uso de ácido fólico e ITS, isolados ou associadosdurante o cultivo individual, foi observado que somente no grupo individual na presença de ITS, produção de embriões foi semelhante ao cultivado em grupo (P>0,05). No segundo experimento, dos 10 genes avaliados nas biópsias de CCs imaturas e maturadas, 2 genes apresentaram diferenças no nível de RNAm entre os grupos. O gene LUM mostrou-se mais expresso (P=0,02), enquanto que FSHR mostrou-se menos expresso (P= 0,09), ambos em CC maturadas de CCOs que desenvolveram em embrião, comparado as do grupo que não desenvolveu embrião. Conclui-se que o cultivo em gotas na presença de ITS proporcionou as melhores taxas de embriões e, que apesar do ácido fólico não afetar a produção altera o padrão de metilação do DNA. A expressão dos genes LUM e FSHR, em CCs maturadas está associada a capacidade do ovócito de formar embrião, podendo ser utilizados como marcadores não invasivos da competência ovocitária. / The present study aimed to determine the best individal culture system to be used in vitro embryo production and to determine the quantity of genes transcrits in immature and matures cumulus (CC) cells biopsies obtained from cumulus-oocytes-complexes (COCs) with high and low capacity to produce embryos. Two experiments were carried out, in the first one the effect of two types of individual culture (microdroplets 20 μL and Cell Tak) on embryo production, the use of folic acid at different concentrations (0, 10, 20, 50 and 500 μM) on embryo production and methylation pattern, and the use of folic acid alone or in combination with ITS during individual culture on embryo production and quality were evaluated. In the second experiment, the relative amount of mRNA for GPC4, PTGS2, LUM, ALCAM, FSHR, PGR, GPX3, SERPINE2, HAS2 and PRDX3 genes was determined by real-time PCR (qPCR) in immature and mature CC biopsies. The biopsies were pooled according to the embryo production results as CCOs that formed blastocyst in D7 (embryo); CCOs that did not cleave (not cleaved) and CCOs that cleaved but did not reach the blastocyst (cleaved). On the first experiment, it was observed that the Cell Tak group presented lower cleavage at D2 and blastocyst rates at D7 and D8 compared to the control and the 20 μL microdroplets groups. Regarding the different concentrations of folic acid, the 500μM group showed lower rates of cleavage and blastocyst at D6 (P≤0.05), compared to the others groups. On D7, no differences were observed between the groups and the control. As for methylation, α-Satellite region, all treatments were similar, (P> 0.05) and presented a hypomethylated pattern. For the exon 10 region of the IGF2 gene, it observed that, the groups exposed to acid folic, either 20 μM or 500 μM, had a difference methylation pattern compared to the control group (P ≤0.05). The results for the use of folic acid and ITS isolated or in combination during individual culture, showed that only the individual group exposed to ITS had similar embryo production to the control group (P> 0.05). In the second experiment, from 10 genes evaluated in CCs biopsies, two genes had differences in mRNA levels. The LUM gene was more expressed (P = 0.02), whereas FSHR was less expressed (P = 0.09) in maturated CC obtained from CCOs that developed into embryo, compared to the ones that did not. It can be concluded that individual culture in microdrops in the presence of ITS gave the highest embryo production and that although folic acid does not increase embryo development it changes their methylation pattern. In addition, the expression of the LUM and FSHR genes in CC is associated with the ability of the oocyte to form an embryo and can used as noninvasive markers of oocyte competence.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/31393 |
| Date | 29 September 2017 |
| Creators | Guimarães, Ana Luiza Silva |
| Contributors | Dode, Margot Alves Nunes |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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