Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2010. / Submitted by wiliam de oliveira aguiar (wiliam@bce.unb.br) on 2011-06-30T18:43:41Z
No. of bitstreams: 1
2010_ThiagoSantanaGastardelo.pdf: 3617049 bytes, checksum: ba7950b62a74d73fc6c8c0c9c54ba43a (MD5) / Approved for entry into archive by Guilherme Lourenço Machado(gui.admin@gmail.com) on 2011-07-06T13:41:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1
2010_ThiagoSantanaGastardelo.pdf: 3617049 bytes, checksum: ba7950b62a74d73fc6c8c0c9c54ba43a (MD5) / Made available in DSpace on 2011-07-06T13:41:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1
2010_ThiagoSantanaGastardelo.pdf: 3617049 bytes, checksum: ba7950b62a74d73fc6c8c0c9c54ba43a (MD5) / Os patógenos dependem de atividades de peptidases para desempenhar muitos processos fisiológicos, tão bem quanto interagir com seus hospedeiros, destacando peptidases de parasitos como fatores de virulência e, então, potenciais alvos de drogas. O sequenciamento do genoma do cinetoplastídeo Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas, revelou 28 genes que codificam aminopeptidases putativas, dentre as quais estão três metionina-aminopeptidases, duas aspártico-aminopeptidases, duas aminopeptidases sensíveis a puromicina e três leucil-aminopeptidases da família M17. Neste estudo, uma atividade leucil-aminopeptidolítica principal foi identificada em T. cruzi usando Leu-AMC como substrato. Ela foi isolada de formas epimastigotas do parasito por um procedimento cromatográfico de dois passos e associou-se com uma única proteína hexamérica de 320 kDa como determinado por experimentos de velocidade de sedimentação e de dispersão de luz. Ligações dissulfeto intercadeias não participam da organização oligomérica da peptidase ativa. Espectrometria de massa por Peptide mass fingerprint revelou a identidade molecular da enzima como a aminopeptidase EAN97960 predita de T. cruzi, o produto do gene Tc00.1047053508799.240. Análises enzimáticas e moleculares indicaram que esta leucil-aminopeptidase de T. cruzi (LAPTc) pertence à família M17 de peptidases ou família da leucil-aminopeptidase. LAPTc tem uma forte dependência de pH neutro, é mesofílica e conserva sua forma oligomérica até 80 °C. Ao contrário, sua forma recombinante produzida em E. coli, assim como outras LAPs, é termofílica e requer pH alcalino. A atividade desta metalo-aminopeptidase é inibida por bestatina e quelantes de metais tais como 1,10-fenantrolina, é restabelecida por Zn2+, e potencializada por Mn2+ ou Ca2+. A enzima é expressa por todas as formas do T. cruzi e localiza-se no interior de vesículas no citoplasma do parasito. Uma vez que vias de aminoácidos essenciais, incluindo leucina, estão desprovidas em T. cruzi, a LAPTc poderia ter uma função no suprimento nutricional. Além disso, a atividade da peptidase também poderia ter uma função no processamento de peptídeos e proteínas. Nós postulamos que a LAPTc poderia ser um alvo potencial para o desenvolvimento de novas drogas para tratar a infecção de T. cruzi. / Pathogens depend on peptidase activities to accomplish many physiological processes, as well as to interact with their hosts, highlighting parasitic peptidases as virulence factors and, thus, potential drug targets. The kinetoplastid Trypanosoma cruzi genome sequencing, the aetiological agent of Chagas disease, has revealed 28 genes encoding putative aminopeptidases, among which there are three methionine, two aspartic, two puramycin-sensitive and three leucyl aminopeptidases of the M17 family. In this study, a major leucyl aminopeptidolytic activity was identified in the T. cruzi by using leu-AMC as substrate. It was isolated from epimastigote forms of the parasite by a two-step chromatographic procedure and associated with a single 320-kDa homohexameric protein as determined by sedimentation velocity and light scattering experiments. Interchain disulfide bonds do not take part in the oligomeric assembly of the active peptidase. Peptide mass fingerprinting revealed the molecular identity of the enzyme as the predicted T. cruzi aminopeptidase EAN97960, the product of the Tc00.1047053508799.240 gene. Molecular and enzymatic analysis indicated that this leucyl aminopeptidase of T. cruzi (LAPTc) belongs to the peptidase family M17 or leucyl aminopeptidase family. LAPTc has a strong dependence on neutral pH, is mesophilic and retains its oligomeric form up to 80 °C. Conversely, its recombinant form produced in E. coli, like other LAPs, is thermophilic and requires alkaline pH. The activity of this metalloaminopeptidase is inhibited by bestatin and metal chelants such as 1,10-phenanthroline, is restored by Zn2+, and potentiated by Mn2+ or Ca2+. The enzyme is expressed by all T. cruzi forms and localizes within vesicles in the cytoplasm of the parasite. Since biosynthetic pathways for essential amino acids, including leucine, are lacking in T. cruzi, LAPTc could have a function in nutritional supply. Furthermore, the peptidase activity could also play a role in peptide and protein processing. We postulate that the LAPTc might be a potential target for the development of new drugs to treat T. cruzi infection.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/8943 |
| Date | 24 September 2010 |
| Creators | Gastardelo, Thiago Santana |
| Contributors | Félix, Carlos Roberto |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.002 seconds