Orientador: Júlio César Teixeira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-27T00:35:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2015 / Resumo: Introdução: O agente etiológico do câncer do colo do útero é um HPV de alto risco (hrHPV) e testes biomoleculares para detecção deste vírus em amostras do colo do útero tendem a ter um papel cada vez mais importante no rastreamento de lesões pré-câncer para o futuro. No momento, estes testes são de alto custo e de execução complexa. Objetivo: desenvolver e padronizar um teste de PCR multiplex marcado com fluorescência para detecção de DNA de hrHPV em amostras obtidas do colo do útero e comparar com um teste de referência. Metodologia: foi realizado um estudo piloto para descrição e padronização de uma metodologia de detecção e genotipagem de HPV, tipo PCR multiplex, com primers desenhados com base na região E7 de seis hrHPV (16, 18, 31, 33, 45 e 52), o teste `E7-HPV¿. Foi seguido um guia internacional para desenvolvimento de novos testes de HPV para rastreamento, que orienta uma avaliação inicial de 50 ou mais amostras de mulheres com NIC2+, comparação com um teste referência validado, e alcançar um índice de concordância kappa de 0,7, com sensibilidade de 90% da sensibilidade do teste referência. O teste referência adotado foi o cobas® HPV Test da Roche Diagnostics, chamado `cobas®¿, que identifica em grupo 12 hrHPV e genotipa os tipos 16 e 18, separadamente. Neste estudo foram utilizadas amostras de 60 pacientes, 55 com citologia ASCH/HSIL, coletadas entre Agosto e Setembro de 2013, que foram avaliadas por cada teste com cálculo da concordância dos resultados pelo índice de kappa e comparação da sensibilidade, com poder estatístico de 90%. Resultados: o teste teve sua descrição e padronização finalizada. Houve alta concordância entre os testes `E7-HPV¿ e cobas® na detecção do HPV 16 com kappa 0,972, com apenas um caso discordante, de paciente com NIC3 com cobas® negativo e com o teste `E7-HPV¿ positivo. Para o HPV18, os resultados dos testes demonstraram concordância total, com índice kappa=1,0. Quando comparadas as detecções dos tipos hrHPV não 16 e 18, seis casos foram positivos para o cobas® e negativos para o teste `E7-HPV¿, podendo ser decorrente da detecção do cobas® de tipos de HPV não contemplados no teste `E7-HPV¿. Ao contrário, o teste `E7-HPV¿ detectou dois hrHPV adicionais, com cobas® negativo (HPV31 e 52). A sensibilidade de detecção de NIC2+ foi igual para os dois testes avaliados. Conclusão: Foi possível desenvolver e padronizar uma técnica de PCR multiplex com metodologia para detecção de seis hrHPV. O desempenho do teste `E7-HPV¿ foi, pelo menos, equivalente ao teste referência (cobas® HPV Test) com kappa=0,972 e 100% da sensibilidade do teste referência na detecção de NIC2+ em pacientes sabidamente com lesões, superando os pré-requisitos necessários. Assim, os resultados satisfatórios do `E7-HPV¿ na primeira fase de avaliação possibilita a continuidade do desenvolvimento do mesmo, visando futura aplicação em maior escala / Abstract: Introduction: the etiologic agent of cervical cancer is a high-risk HPV (hrHPV) and biomolecular tests for detection of this virus in cervical samples tend to have an increasingly important role in screening for precancerous lesions for the future. At present, these tests are expensive and complex procedure. Purpose: to develop and standardize a multiplex PCR test, 'E7-HPV' test, to detect and genotyping of 6 hr-HPV DNA, tested in samples obtained from the cervix and compared with a reference test. Methods: A pilot study was performed to develop and standardize a methodology of the multiplex PCR with primers designed on the basis of six hrHPV E7 region (16, 18, 31, 33, 45 and 52) and labeled with fluorochrome 6-FAM. Viral detection was performed by capillary electrophoresis in automated sequencer. It was followed an international guide to development of new HPV testing for screening, which guides an initial assessment of 50 or more samples from women with CIN2+, and the results compared to a validated reference test to achieve a kappa index of 0.7, and 90% sensitivity of reference sensitivity test. The reference test adopted was the cobas® HPV Test from Roche Diagnostics, called 'cobas®', which identifies 12 hrHPV pooled and genotype HPV 16 and 18 separately. In this study, cervix samples were obtained from 60 women, 55 with ASCH/HSIL cytology, collected between August to September 2013. The samples were evaluated by each test, and a non-inferiority analysis was conducted in relation to the cobas® HPV Test, following international guidelines for the development of new tests with kappa index and sensitivity, with a statistical power of 90%. Results: The methodology of E7-HPV test was described and standardized. The 'E7-HPV' test and cobas® Test had a high concordance rate in HPV16 detection (kappa=0.972), with only one discordant case (CIN3 with negative cobas® and `E7-HPV¿ HPV16 positive) and total concordance in HPV18 detection (kappa=1.0). When comparing the detection of hrHPV not 16/18, six cases were positive for cobas® and negative for 'E7-HPV', maybe due to the detection for cobas® of HPV types not included in the 'E7- HPV ' test. Others three cases were `E7-HPV¿ positive (HPV16, 31 and 52) with negative cobas®. For diagnosis of CIN2 or worse, both tests had the same sensitivity. Conclusion: It was possible to develop and standardize a multiplex PCR methodology for detection and genotyping 6 hrHPV in cervical samples. The performance of 'E7-HPV' test was at least equivalent to the reference test for the detection of CIN2+, fulfilling the clinical validation criteria requirements. Thus, the satisfactory initial results of the 'E7-HPV' test evaluation indicate that the development can be continued, aiming future application on a larger scale / Mestrado / Oncologia Ginecológica e Mamária / Mestra em Ciências da Saúde
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unicamp.br:REPOSIP/312780 |
| Date | 27 August 2018 |
| Creators | Paes, Eliana Ferreira, 1976- |
| Contributors | UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS, Teixeira, Júlio César, 1965-, Martins, Cecilia Maria Roteli, Zeferino, Luiz Carlos |
| Publisher | [s.n.], Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas, Programa de Pós-Graduação em Tocoginecologia |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | 100 p. : il., application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da Unicamp, instname:Universidade Estadual de Campinas, instacron:UNICAMP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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