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Previous issue date: 2009 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Ministerio de Planificación de Chile (MIDEPLAN) / Em nosso laboratório foi isolado um clone recombinante de T. cruzi, denominado H49,
que codifica repetições de 68 aminoácidos (aa) dispostas em tandem. Estas repetições são
encontradas em um antígeno imunodominante de aproximadamente 240 kDa que está envolvido
na ligação do flagelo ao corpo do parasita, conhecida como zona FAZ. Este trabalho relata a
caracterização da estrutura do gene e da proteína H49. Buscas no banco de dados de T. cruzi
utilizando o algoritmo BLAST revelaram que as repetições de 68 aa são encontradas em uma
região central de oito calpaínas-like cisteínas peptidases. Em duas dessas, as repetições H49 são
altamente conservadas e organizadas em tandem. Nas outras seis calpaínas-like encontradas, as
repetições eram degeneradas e podem ser separadas por pequenas seqüências não repetitivas.
Essas proteínas apresentaram domínios característicos de cisteínas proteinases cálciodependente,
como Cys-Pc e Calpain_III. A associação entre as seqüências H49 e calpaína foi
confirmada por amplificação por PCR e análises de clones de YAC utilizando oligonucleotídeos
específicos para amplificar regiões especificas de calpaína e repetições H49. O locus H49 foi
mapeado no clone CL Brener utilizando uma sobreposição de clones de YAC. A associação da
repetição H49 e calpaínas nos YACs foi demonstrada por PCR e por análise de restrição.
Corroborando com dados obtidos, a análise por “chromoblot” revelou que as sondas H49 e
calpaína hibridizam com as mesmas bandas cromossômicas. Nossos dados indicam que as
repetições H49 fazem parte de um subgrupo de genes da calpaína e, portanto, denominados
H49/calpaína. Recentemente uma nova família de proteínas associadas ao citoesqueleto foi
descrita em Trypanosoma brucei e Leishmania. Estas proteínas são caracterizadas por sua
similaridade com a região catalítica da calpaína, assim como pela presença de seqüências de
aminoácidos repetidas em tandem que apresentam similaridade de 30-40% com a repetição H49.
Esses resultados sugerem que a aquisição da calpaína, contendo repetições pelos
tripanossomatídeos (talvez por fusão de genes) foi um evento tardio na evolução dessa família de
proteínas.
Para avaliar a ocorrência e a distribuição subcelular da proteína H49/calpaína em epimastigotas,
diferentes domínios da calpaína e da repetição de 68 aa foram expressas em bactérias, as
proteínas foram purificadas e utilizadas na imunização de coelhos e camundongos. Os anticorpos
policlonais purificados foram utilizados para estudar a organização e distribuição subcelular das
repetiçãos de 68 aa e calpaína em T. cruzi. Em “immunoblotting”, anticorpos contra o domínio
calpaína e contra as repetições de 68 aa reagiram com uma proteína de 240 kDa presente no
extrato total de epimastigotas. Anticorpos anti-calpaína reagiram com bandas adicionais de
aproximadamente 170, 60 e 56 kDa que correspondem a calpaínas sem as repetições de 68 aa.
Análise de imunofluorescência revelou que a proteína H49/calpaína está localizada apenas na
região de adesão entre o corpo celular e o flagelo. A calpaína, além de ser encontrada no flagelo,
também é encontrada no citoplasma. Além disso, a H49/calpaína associada ao citoesqueleto colocalizou
com marcadores da zona de adesão flagelar (FAZ).
Domínios repetitivos da H49/calpaína contem alfa hélices (“helix-turn-helix”) que poderiam
estar organizadas em uma estrutura enovelada em uma estrutura “coiled-coil”. Sugerimos que as
proteínas H49/calpaína formariam um homodímero que poderia ligar a membrana do flagelo à
membrana do corpo celular na zona de adesão flagelar. / We have previously isolated a T. cruzi recombinant clone, termed H49, that encodes
tandemly arranged repeats of 68-amino acids (aa). The repeats are found in an immunodominant
antigen (~240 kDa) which is involved in the attachment of the flagellum to the cell body in the
FAZ region of the parasite. Here we present further characterization of the structure of H49 gene
and protein. Blast search of T. cruzi databases showed that the 68-aa repeats can be found in the
central domain of 8 calpain-like cysteine peptidases. In two of them, the H49 repeats are highly
conserved and arranged in tandem arrays, whereas in other calpains the repeats are degenerated
and can be separated by short nonrepeat sequences. These proteins show the domains Cys-Pc and
calpain_III, characteristics of calcium-dependent cysteine proteinases. The association between
H49 and calpain sequences was further confirmed by PCR amplification and analysis of YAC
clones using primers designed to amplify specific regions of calpain and H49 repeat. We mapped
the H49 locus in clone CL Brener using YAC overlapping clones. The association of H49 and
calpain in these YACs was demonstrated by PCR and restriction analysis. Consistent with this,
chromoblot analysis revealed that H49 and calpain probes hybridized with the same
chromosomal bands. Our data indicate that the H49 repeats are part of a subset of calpain genes,
and they were termed H49/calpains. Recently, a novel family of cytoskeleton-associated proteins
was described in Trypanosoma brucei and Leishmania. These proteins are characterized by their
similarity to the catalytic region of calpain, and also by the presence of tandemly arranged amino
acid repeats that share 30-40% similarity with H49. These results suggest that the acquisition by
trypanosomatids of calpain containing repeats (maybe by gene fusion) was a relatively late event
in the evolution of this family of proteins.
To study the occurrence and subcellular distribution of H49/calpain protein in
epimastigotes, we have expressed different domains of the calpain and the 68-aa repeats in
bacteria, purified the proteins, and employed them to immunize rabbits and mice. The affinity
purified polyclonal antibodies were used as probes to study the organization and subcellular
distribution of 68-aa repeats and calpain in T. cruzi. Antibodies raised against the calpain
domains and 68-aa repeats reacted, by immunoblot analysis, with a ~240 kDa protein in the
whole epimastigote extracts. Anti-calpain antibodies reacted with additional bands of ~170, 60
and ~56 kDa which correspond to the calpain proteins without 68-aa repeats.
Immunofluorescence analysis showed that H49/calpain-like protein is only localized in the
region of adhesion between the cell body and flagellum. Calpain was present not only in the
flagella, but it was also localized in the cytoplasm. Further, the cytoskeleton-associated
H49/calpain was colocalized with markers of the flagellar attachment zone (FAZ).
Repetitive domain of H49/calpains contain alpha-helices (helix-turn-helix) that could be
arranged in a coiled-coil rope-like structure. We suggest that H49/calpain proteins form a
homodimer that could link the flagellar membrane to the cell body membrane at the flagellar
attachment zone. / BV UNIFESP: Teses e dissertações
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unifesp.br:11600/10409 |
| Date | January 2009 |
| Creators | Carabantes, Alexandra Lena Galetovic [UNIFESP] |
| Contributors | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Silveira, Jose Franco da [UNIFESP] |
| Publisher | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | 176 f. |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UNIFESP, instname:Universidade Federal de São Paulo, instacron:UNIFESP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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