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Previous issue date: 2010-10-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Paracoccidiodes brasiliensis é o fungo termodimórifco patogênico causador da Paracoccidioidomicose (PCM). Esse agente infeccioso produz antígenos importantes como a gp43, já bem caracterizada, e a glicoproteína de 70 kDa (gp70) que é reconhecida por 96% dos soros de pacientes com PCM. No presente estudo reportamos que o gene codificador do antígeno gp70 possui uma fase de leitura aberta de 2.154 pares de bases. A estratégia utilizada na clonagem do gene PbGP70 incluiu análises in silico de sequências contidas no banco de dados de sequências expressas de P. brasiliensis (P. brasiliensis’ Expressed Sequence Tags Databank) e sequenciamento por meio da técnica de primer-walking. A análise da sequência da proteína deduzida mostrou a presença de dois motivos para Nglicosilação, epítopos para células B e T com putativas funções antigênicas e protetoras, respectivamente. Análises comparativas in silico classificaram a proteína pertencente à família das flavoproteínas monoxigenases. Muitas proteínas dessa família possuem funções antioxidativas em diversos modelos biológicos e são compostos bioativos importantes. Anticorpos policlonais produzidos contra gp70 recombinante foram capazes de reconhecer a proteína nativa no extrato celular total de P. brasiliensis. A proteína recombinante parcial foi reconhecida por 5 de 7 soros de pacientes com PCM e pelo anticorpo monoclonal previamente produzido contra gp70 nativa (MAb C5F11). Experimentos de microscopia confocal com o anticorpo policlonal anti-gp70 recombinante e o MAb C5F11 mostraram co-localização da marcação citoplasmática, como esperado para gp70. Análises da expressão gênica por RT-PCR quantitativo em tempo real mostraram baixos níveis de expressão do gene PbGP70 em condições normais, porém sob condições de estresse oxidativo, induzido pela adição de H2O2 e durante o crescimento do fungo, a expressão foi significativamente aumentada. Por fim, após incubação de células leveduriformes de P. brasiliensis com macrófagos derivados de medula óssea, foi observado aumento da expressão gênica nas leveduras aderidas ou fagocitadas após 24 horas e, nas leveduras não aderidas, a expressão foi aumentada após 48 horas. Esses achados sugerem que a gp70 possa desempenhar um papel duplo na biologia e infecção por P. brasiliensis. Por um lado, a molécula estimula resposta imune celular e humoral no hospedeiro e por outro protege o fungo do estresse oxidativo gerado por células fagocíticas. / Paracoccidioides brasiliensis is a thermodimorphic pathogenic fungus that
causes Paracoccidioidomycosis (PCM). This infectious agent produces important
antigens as gp43, already fully characterized, and a 70 kDa glycoprotein (gp70)
recognized by 96% PCM patients’ sera. In the present study, we report that the gene
encoding gp70 antigen has an open reading frame in a 2,154 base pair fragment.
The gp70 gene in P. brasiliensis (PbGP70) has been cloned using in silico screening
of the P. brasiliensis' Expressed Sequence Tag databank and primer-walking
sequencing approach. In the deduced protein sequence, we found two motifs for Nglycosilation,
B and T-cell epitopes, with putative antigenic and protector functions,
respectively. Comparative in silico analysis showed that this protein belongs to
flavoprotein monooxygenasis family. Many proteins of this family show anti-oxidative
functions in several biologic models thus, being important bioactive compounds. Antirecombinant
gp70 polyclonal antibodies recognized the native protein in the total cell
extract of P. brasiliensis. Moreover, the partial recombinant protein was recognized
by 5 out of 7 PCM pacients’ sera and by the gp70 C5F11 monoclonal antibody
previously produced against native gp70. Confocal microscopy with polyclonal
antibodies anti-gp70 recombinant and C5F11 MAb anti-native gp70, showed colocalization
in the cell cytoplasm, as expected for gp70. Gene expression analysis
using Real-Time PCR showed low levels of gp70 gene expression in normal
conditions, but under oxidative stress induced by H2O2 and during the fungal growth,
expression is significantly increased. Finally, when we incubated P. brasiliensis with
bone-marrow derived macrophages, the phagocyted or attached cells showed
increased gp70 gene expression at 24 hours and, in the non-phagocyted cells, the
expression was increased after 48 hours. These findings suggest that gp70 might
play a dual role in P. brasiliensis, both eliciting immune cellular and humoral
responses in the host and protecting the fungus from oxidative stress generated by
phagocytic cells. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unifesp.br:11600/9203 |
| Date | 28 October 2010 |
| Creators | Maricato, Juliana Terzi [UNIFESP] |
| Contributors | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Lopes, Jose Daniel [UNIFESP] |
| Publisher | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | 139 f. |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UNIFESP, instname:Universidade Federal de São Paulo, instacron:UNIFESP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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