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Previous issue date: 2016-11-28 / Most organisms have circadian rhythms with a periodicity of 24-hour that are generated by an endogenous mechanism, the molecular clock, which has the ability to synchronize biological functions with environmental signals. This mechanism has fundamental importance in the homeostasis of the tissues that are under its influence. Among the genes of the molecular clock machinery, the clock and bmal are positive regulators of clock mechanism and they present sigmoid expression profile in the skeletal muscle in zebrafish (Danio rerio). CLOCK and BMAL participate on the activation of the myogenic regulatory factors (MRFs - myoD, myog, myf5 and myf6), which are important in the development and differentiation of muscle cells. Despite this knowledge, the physiological importance of circadian rhythm in skeletal muscle of fish is not known. Therefore, the objective of the present study was to produce a zebrafish transgenic lineage that expresses bmal1a constitutively in the skeletal muscle to investigate the role of the molecular clock in the muscle. The transfer rate of the transgene to offspring, effect of transgenesis in the survival and fish growth, and expression of the bmal1a, clock1a and MRFs were investigated. The founding transgenic population (F0) was obtained after microinjection, and positive larvae were observed as specimens which presented green fluorescent heart. F1 was obtained from natural crossings between F0 and NT fish. Likewise, F2 was obtained from F1. F2 transgenic and NT were used in this study. The transgenic lineage was successfully generated with 50% transmission from the transgene to the offspring following a Mendelian model. The analysis of gene expression was made by qPCR. The survival (41,4±0% F2 and 44,3±6% NT) and growth (3.7±0.1 cm F2 and 3.8±0.2 cm NT) of F2 were not statistically different from NT fish. Among the genes, clock1a and myog presented statistically significant differences between the lineages with circadian profile in NT fish, suggesting that myog may be a clock controlled genes. The other genes (bmal1a, myf5, myf6, and myoD) presented constitutive expression. In general, it can be verified that the constitutive expression of bmal1a did not present change in the expression of the molecular clock, not affecting the homeostasis of the skeletal muscle, survival and growth. / A maioria dos organismos apresentam ritmos circadianos em torno de um período de 24 horas que são gerados por um mecanismo endógeno, o relógio molecular, que tem a capacidade de sincronizar-se com sinais ambientais. Este mecanismo tem fundamental importância na homeostase dos tecidos que estão sob sua influência. Dentre os genes que compõem a maquinaria do relógio molecular os genes clock e bmal são os reguladores positivos do mecanismo desse relógio e apresentam expressão com perfil sigmoide em tecido como o músculo do peixe-zebra (Danio rerio), participando da ativação de alguns fatores regulatórios miogênicos (MRFs – myoD, myog, myf5 e myf6), os quais possuem importância para o desenvolvimento e diferenciação do músculo. Apesar deste conhecimento, não se sabe a importância fisiológica do ritmo de expressão circadiana no músculo esquelético de peixes. Neste sentido, o objetivo desse estudo foi investigar a taxa de transferência do transgene para a prole; se a transgenia para o gene bmal1a no músculo esquelético interferiu na sobrevivência e crescimento dos peixes; e avaliar se a expressão dos genes bmal1a, clock1a e MRFs apresentaram diferenças na linhagem transgênica comparada à linhagem não-transgênica (NT). Os fundadores (F0) foram obtidos após a microinjeção do plasmídeo e as larvas positivas foram observadas com coração verde fluorescente. A F1 foi obtida a partir de cruzamentos entre peixes F0 e NT. Da mesma forma, F2 foi obtida a partir da F1, os quais foram utilizados no presente estudo. A análise da expressão gênica das linhagens aos 11 meses de idade foi realizada utilizando a técnica qPCR. A linhagem transgênica foi gerada com sucesso, transmitindo o transgene para a prole seguindo a herança mendeliana. A sobrevivência e crescimento da prole F2 não apresentaram diferenças entre as linhagens, sendo 41,4±0% para a linhagem transgênica e 44,3±6% NT até 30 dpf e 3.7±0.1 cm transgênicos e 3.8±0.2 cm para NT aos 11 meses de idade, respectivamente. Dentre os genes, o clock1a e o myog apresentaram diferenças estatisticamente significativas entre as linhagens com perfil circadiano em peixes NT, sugerindo que myog seja um gene controlado pelo relógio. Os demais genes apresentaram expressão constitutiva. De um modo geral, pode-se verificar que a expressão constitutiva do bmal1a não apresentou alteração na expressão do relógio molecular, desta forma, não afetou a homeostasia do organismo, a sobrevivência das larvas, bem como não afetou o crescimento.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede.biblioteca.ufpb.br:tede/8838 |
| Date | 28 November 2016 |
| Creators | Sousa, Jucilene Pereira de |
| Contributors | Amaral, Ian Porto Gurgel do |
| Publisher | Universidade Federal da Paraíba, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, UFPB, Brasil, Biotecnologia |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFPB, instname:Universidade Federal da Paraíba, instacron:UFPB |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 373623392066066074, 600, 600, 600, 1239993683399922716, -3439178843068202161 |
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