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Previous issue date: 2007-06-22 / The fungi Fusarium graminearum (teleomorph Gibberella zeae) is the etiological agent of
scab wheat, one of the most important cereal s winter diseases in Brazil. Outbreaks are
generally sporadic but in the last few years is frequently reported an increase in disease
intensity in almost all the wheat producing areas around the world. Some studies demonstrate
a high genetic diversity in F. graminearum from different geographic areas, as well as in
isolates at the same locality. In filamentous fungi, as the F. graminearum, one of the main
mutation s causes is the transposable elements or transposons which are capable to generate
different types of mutations. In some cases, these mutations are involved with the resistance
break, an important phenomenon for the occurrence of epidemics. The objectives of this study
were to detect putative transposable elements sequences in the F. graminearum genome, as
well as to develop and to analyze adequate procedures for co-transformation of brazilin
isolates of this fungi with the vectors pNI160, which carry the transposon impala and pAN7.1,
which code to hygromycin B resistance. To detect putative sequences of transposable
elements in the F. graminearum genome, specifics oligonucleotides were constructed and 14
isolates, originated from the States of Rio Grande do Sul, Paraná and São Paulo were used. A
total of 10 oligonucleotides pairs were constructed (6 oligonucleotides pairs were specific to
transposase, 3 to transcriptase reverse and 1 to gene that code for GAG protein). Considering
these 10 oligonucleotides pairs, the one that would amplify a transcriptase reverse region
similar to a Magnaporthe grisea reverse transcriptase did not amplify any fragment in the
isolates total DNA, and the pair that would amplify a transposase region similar to
Metarhizium anisopliae originated many fragments of different sizes that do not show relation
with 683 bp expected size fragment. Considering the eight oligonucleotides pairs remained,
five of them amplified the expected fragments for transposase (715 bp region similar to F.
oxysporum f. sp. ciceris transposase, 306 bp similar to Aspergillus awamori transposase, 556
bp similar to A. niger tansposase, 339 bp similar to Arabdopsis thaliana transposase and 554
bp similar to Cochliobolus carbonum transposase), two of them amplified the transcriptase
reverse fragments (161 bp similar to A. thaliana reverse transcriptase and the 752 bp similar
to Caenorhabditis elegans reverse transcriptase) and one oligonucleotide pair amplified an
581 bp expected size fragment similar to F. oxysporum gag gene. The amplification occurred,
even for different oligonucleotides pairs, in all 14 analyzed isolates confirming the presence
of transposable elements putative sequences in Brazilian isolates of F. graminearum. This
also shows a diversity of groups of these putative elements, considering that some of the
sequence amplified is characteristic of a transposable element specific group. To develop the
genic inactivation protocol, we select the isolates F02 and F12 which are pathogenic for
BR18-Terena cultivar. To evaluate the better medium for selection of chlorate resistant
mutants, it was analyzed two different medium. This analysis showed that medium describe
by Cove (1979) is more indicate for selected the chlorate resistant mutants. A total of 15
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chorate resistant mutants were obtained, being five identified as nitrate reductase mutants
(niaD), eight specific regulator mutants (nirA) and two permease mutants. Differences related
to the number of mutants obtained and number inoculated plates, number of nitrate reductase
mutants and macroconides production indicate that the choice of the isolate can influence the
isolation of mutants and in protoplast production. Analysis with different hygromycin B
concentrations revealed that doses up to 30 μg.mL-1 were enough to control the fungal
growth. Two nitrate reductase mutants (M01 and M194) were select to protoplastization and
co-transformation, once these two mutants in relation to others produce lower concentration
of residual mycelium. Only one transformant were obtained and it was denominated T3, what
shows that the transformation protocol needs to be modified to increase the number of
transformants. If hybridization experiments confirm the transformation of T3 with only one
copy of the impala element, it will be confirmed the transposition ability of impala in F.
graminearum, and it will be useful in genetic inactivation studies, especially to genes
involved in pathogenicity process / O fungo Fusarium graminearum (teleomorfo Gibberella zeae) é o agente etiológico da
giberela do trigo, atualmente uma das principais doenças de inverno no Brasil. Epidemias
ocorrem esporadicamente, embora nos últimos anos, registraram-se incrementos na
intensidade da doença em quase todas as áreas produtoras de trigo no mundo. Vários estudos
demonstram uma grande diversidade genética em isolados de F. graminearum de diferentes
áreas geográficas, como também em isolados de uma mesma localidade. Em fungos
filamentosos como o F. graminearum, uma das principais fontes de mutações capaz de gerar
alta variabilidade genética são os elementos transponíveis ou transposons. Essas mutações
algumas vezes estão envolvidas com a quebra de resistência, fenômeno importante para o
surgimento de epidemias. Os objetivos deste trabalho foram de detectar putativas seqüências
de elementos transponíveis no genoma deste fungo, bem como, desenvolver e analisar
procedimentos e métodos adequados para a co-transformação de isolados brasileiros deste
fungo com o plasmídio pNI160, o qual carrega o transposon impala, e o plasmídio pAN7.1, no
qual esta inserido o gene de resistência a higromicina B. Para detectar putativas seqüências de
elementos transponíveis no genoma deste patógeno foram construídos oligonucleotídeos
específicos para amplificação, via PCR de seqüências características destes elementos
transponíveis. Foram utilizados 14 isolados de F. graminearum, provenientes dos Estados do
Rio Grande do Sul, Paraná e São Paulo e um total de 10 pares de oligonucleotídeos foram
construídos (6 pares para genes que codificam a enzima transposase, 3 pares para genes que
codificam a enzima transcriptase reversa e 1 par um gene que codifica a proteína GAG). Dos
10 pares de oligonucleotídeos utilizados, o par que amplificaria uma região de transcriptase
reversa similar ao mesmo gene de Magnaporthe grisea não amplificou nenhum fragmento nos
isolados utilizados, e o par que amplificaria uma região de transposase similar ao mesmo gene
de Metarhizium anisopliae originou muitos fragmentos de diferentes tamanhos não
condizentes com o tamanho esperado de 683 pb. Dos oito pares de oligonucleotídeos
restantes, cinco amplificaram as regiões esperadas para a transposase (regiões de 715 pb
similar a uma transposase de F. oxysporum f. sp. ciceris, 306 pb similar a uma transposase de
Aspergillus awamori, 556 pb similar a uma transposase de A. niger, 339 pb similar a uma
transposase de Arabidopsis thaliana e 554 pb similar a uma transposase de Cochliobolus
carbonum), dois amplificaram as regiões de transcriptase reversa (regiões de 161 pb similar a
uma transcriptase reversa de A. thaliana e 752 pb similar a uma transcriptase reversa de
Caenorhabditis elegans) e um amplificou um fragmento de tamanho esperado de 581 pb
similar ao gene gag de F. oxysporum. A amplificação ocorreu, mesmo que para diferentes
pares de oligonucleotídeos, em todos os 14 isolados analisados, confirmando a presença de
seqüências putativas de elementos transponíveis em isolados de F. graminearum provenientes
de diferentes regiões do Brasil, além de demonstrar uma diversidade de classes de putativos
elementos, uma vez que cada seqüência é característica de um determinado grupo de
elementos transponíveis. Para o desenvolvimento do protocolo de inativação gênica foram
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selecionados os solados F02 e F12 patogênicos a cultivar BR18-Terena. Um teste para
avaliação do meio de cultura para seleção dos mutantes resistentes ao clorato demonstrou que
o meio descrito por Cove (1979) é o mais indicado para os isolados selecionados. Um total de
15 isolados mutantes resistentes ao clorato foi obtido, dos quais 5 foram identificados como
mutantes para o gene nitrato redutase (niaD), 8 mutantes para um regulador específico (nirA)
e 2 mutantes para permease. Diferenças quanto ao número de mutantes selecionados pelo
número de placas inoculadas, número de mutantes nitrato redutase e produção de esporos
assexuais, indicam que a escolha do isolado pode influenciar na obtenção de mutantes e na
produção de protoplastos. Testes com diferentes concentrações de higromicina revelaram que
doses acima de 30 μg. mL-1 são suficientes para o controle do crescimento do fungo. Dois
mutantes nitrato redutase (M01 e M194) foram selecionados para a protoplastização e cotransformação,
com base na menor produção de micélio residual em relação aos demais.
Apenas um transformante foi obtido sendo denominado T3, mostrando a viabilidade do
protocolo, mas também, que mais estudos devem ser realizados para se aumentar o número de
transformantes. Se confirmada, através de hibridização, a transformação de T3 com uma única
cópia do elemento impala, este poderá além de confirmar a capacidade de transposição deste
elemento em F. graminearum, também servir em estudos de expressão gênica, principalmente
àqueles genes envolvidos no processo de patogenicidade
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede.udesc.br #179.97.105.11:handle/1073 |
| Date | 22 June 2007 |
| Creators | Leão, Ricardo Costa |
| Contributors | Guidolin, Altamir Frederico |
| Publisher | Universidade do Estado de Santa Catarina, Mestrado em Produção Vegetal, UDESC, BR, Produção Vegetal |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UDESC, instname:Universidade do Estado de Santa Catarina, instacron:UDESC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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