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Previous issue date: 2010-12-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Embryo cryopreservation is an important tool that allows the storage of genetic
material for long time, without loss of functional activity or genetic damage. Cryopreservation
of in vivo-produced embryos is well established and provides similar results than those
obtained after fresh embryos transfer. However, in vitro-produced (IVP) bovine embryos are
easily damaged by conventional methods of cryopreservation, resulting in low survival rates
after re-warming. Such sensitivity seems to be related to an excessive amount of lipid in the
embryos cytoplasm during in vitro development. This might occur due to serum containing
medium cultured embryos. Mechanical removal of lipid droplets can improve survival of
early developmental stages embryos after cryopreservation. Nevertheless, delipidation method
are laborious and time-consuming, besides altering embryo development after transfer to the
recipients. Therefore, studies have searched for non invasive and less laborious techniques to
reduce the amount of cytoplasmic lipids of bovine IVP embryos, thus improving their
cryotolerance. Trans-10, cis-12 CLA, a conjugated isomer of linoleic can inhibit the fatty acid
synthesis, thus decreasing the amount of lipid in several human and animal cells. It is known
that lipid synthesis reduction involve down-regulation of mRNA expression of lipogenic
enzymes associated with fat synthesis. Studies showed that addition of t10, c12 CLA to
culture media, can reduce lipid content of bovine IVP embryos, improving their
cryotolerance. Therefore, this study evaluated two CLA isomers on cryotolerance of IVP
bovine embryos, as well as the enzymes acetyl-CoA carboxylase (ACCa), stearoyl-CoA
desaturase (SCD1) and fatty acid synthase (FASN) mRNA expression of these embryos. In
Experiment 1, embryos were cultured in media with increasing concentrations of trans-10,
cis-12 CLA isomer: control group (0 μM), 50CLA group (50 μM), 100CLA group (100 μM)
and 200CLA group (200 μM), looking for the higher concentration that does not negatively
affect embryo development. In Experiment 2, zygotes were cultured in medium containing
100 μM (determined in Experiment 1) of different CLA isomers: control (CLA free) group,
t10, c12 CLA group, c9, t11 CLA group and Mixture (50% c9, t11 CLA + 50% t10, c12)
group. In Experiment 3, zygotes were allocated in 2 groups: CLA group, containing 100 μM
of t10, c12 CLA isomer (determined in Experiment 2) and control (CLA free) group.
Blastocysts were separated according to their stage (Bx or Bl) and subjected to vitrification or
freezing. As viability criteria, cleavage and blastocyst rates were assessed after IVC and reexpanding
and hatching rates were assessed after re-warming. Cell counting and mRNA
expression of the ACCa, SCD1 and FASN enzymes were also assessed. The highest
concentration of t10, c12 CLA that did not impair blastocyst rates was 100μM.In Experiment
2, the highest hatching rate after re-warming was obtained in c9, t11 group, vitrified at Bx
stage (68.6%), not differing from the other treatments vitrified at this stage. The lowest
hatching rate was obtained in Mixture group, vitrified at Bl stage (8.0%), not differing from
the groups t10, c12 and c9, t11, vitrified at the same stage. In all treatments, Bx stage embryos
showed higher viability than Bl stage embryos, except for the Control group, in whose the
viability was similar. In Experiment 3, the highest hatching rate was obtained in Bx stage
Control vitrified group (67.4%), which was similar to the Bx stage vitrified CLA group. The
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lowest hatching rate was observed in Bl stage frozen CLA group (10.3%), not differing from
the other cryopreserved treatments at the same stage. In all frozen groups, despite CLA
addition, hatching rates were all similar. There was also no difference in cell counting or
mRNA expression of the enzymes ACCa, SCD1 and FASN, among embryos.Under the
conditions of this study, the addition of CLA isomers t10, c12 and c9, t11 to culture media
does not improve cryotolerance of IVP bovine embryos, and the isomer t10, c12 CLA does
not influences the cell number and mRNA expression of enzymes ACCa, SCD1 and FASN / A criopreservação de embriões é uma importante ferramenta que permite o
armazenamento de material genético por período prolongado, sem causar perda de atividade
funcional ou alterações genéticas nessas estruturas. A criopreservação de embriões gerados in
vivo está bem estabelecida e proporciona resultados muito próximos aos obtidos após a
transferência de embriões frescos. Já os embriões bovinos produzidos in vitro (PIV) são
extremamente sensíveis aos métodos convencionais de criopreservação, apresentando
reduzidas taxas de sobrevivência após o reaquecimento. Essa sensibilidade parece estar
relacionada ao acúmulo excessivo de lipídeos no citoplasma dos embriões durante o
desenvolvimento in vitro, principalmente quando o cultivo é realizado em meios adicionados
de soro. Estudos realizados com embriões em estágios iniciais de desenvolvimento
evidenciaram que a remoção física das gotas lipídicas é capaz de aumentar a tolerância destes
embriões à criopreservação. Contudo, o método de delipidação é demasiadamente trabalhoso
e demorado, além de alterar o potencial de desenvolvimento dos embriões após a
transferência para as receptoras. Dessa forma, os estudos têm buscado métodos não invasivos
e menos trabalhosos, que reduzam a quantidade de lipídeos no citoplasma dos embriões
bovinos PIV, melhorando assim a sua criotolerância. O trans-10, cis-12 CLA, um isômero
conjugado do ácido linoleico, é capaz de inibir a síntese de ácidos graxos, diminuindo o teor
lipídico em diversos tecidos de animais e humanos. Sabe-se que um dos mecanismos pelos
quais este isômero exerce esse efeito é através da diminuição da expressão de RNAm de
enzimas responsáveis pela síntese de lipídeos. Estudos mostraram que a adição do t10, c12
CLA ao meio de cultivo pode reduzir o acúmulo lipídico de embriões bovinos PIV,
aumentando a sua criotolerância. Assim, este estudo teve como objetivo avaliar o efeito dos
dois principais isômeros do CLA na criotolerância de embriões bovinos PIV e adicionalmente
a expressão de RNAm das enzimas acetil-CoA carboxilase (ACCa), estearoil-CoA
dessaturase (SCD1) e ácido graxo sintase (FASN) desses embriões. No Experimento 1,
embriões foram cultivados em meio com concentrações crescentes do isômero t10, c12 CLA:
grupo controle (0 μM), grupo 50CLA (50 μM), grupo 100CLA (100 μM) e grupo 200CLA
(200 μM), buscando a maior concentração que não afete o posterior desenvolvimento
embrionário. No Experimento 2, os zigotos foram cultivados em meio com 100 μM,
(concentração apontada no Experimento 1) de diferentes isômeros de CLA, sendo: grupo
controle, sem adição de CLA, grupo t10, c12 CLA, grupo c9, t11 CLA e grupo Mistura, com
50% de cada isômero. No Experimento 3, os zigotos foram distribuídos em 2 grupos: grupo
CLA, contendo 100 μM do isômero t10, c12 CLA (determinado no Experimento 2) e grupo
controle, sem CLA. Os blastocistos obtidos foram separados em função do estágio (Bx ou Bl)
e submetidos ao processo de vitrificação ou congelamento. Como critérios de viabilidade
foram avaliados as taxas de clivagem e de blastocistos após o cultivo, e de re-expansão e
eclosão após o reaquecimento. Ainda, foi determinada a densidade celular e a expressão de
RNAm das enzimas ACCa, SCD1 e FASN destes embriões. A maior concentração de t10,
c12 CLA que não reduziu a taxa de blastocistos foi a de 100μM. No Experimento 2, a maior
taxa de eclosão após o reaquecimento foi a do grupo c9, t11 vitrificado no estágio de Bx
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(68,6%), que não diferiu dos demais tratamentos vitrificados neste estágio. A menor taxa de
eclosão foi a do grupo Mistura (c9, t11 + t10, c12, no estágio de Bl (8,0%), que não diferiu
dos grupos t10, c12 e c9, t11, vitrificados no mesmo estágio. Em todos os tratamentos,
embriões em estágio de Bx apresentaram taxas superiores aos Bl, com exceção do grupo
Controle, cujas taxas foram similares. No Experimento 3, a maior taxa de eclosão foi
observada no grupo Controle com Bx vitrificados (67,4%), que não diferiu do grupo CLA,
com Bx vitrificados. A menor taxa de eclosão foi a do grupo CLA com Bl congelados
(10,3%), que não diferiu dos demais tratamentos criopreservados neste estágio. Nos grupos
submetidos ao congelamento, as taxas de desenvolvimento foram semelhantes, independente
da exposição ao CLA. Não houve diferença na densidade celular entre os embriões expostos
ou não ao t10, c12 CLA, e nem na expressão de RNAm das enzimas ACCa, SCD1 e FASN.
Conclui-se que nas condições deste estudo a adição dos isômeros do CLA t10, c12 e c9, t11
ao meio de cultivo não melhora a criotolerância de embriões bovinos PIV, bem como que o
isômero t10, c12 CLA, não interfere na densidade celular e na expressão de RNAm das
enzimas ACCa, SCD1 e FASN destes embriões
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede.udesc.br #179.97.105.11:handle/833 |
| Date | 17 December 2010 |
| Creators | Marinho, Luciana Simões Rafagnin |
| Contributors | Mezzalira, Alceu |
| Publisher | Universidade do Estado de Santa Catarina, Mestrado em Ciência Animal, UDESC, BR, Ciências Veterinárias |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UDESC, instname:Universidade do Estado de Santa Catarina, instacron:UDESC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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