Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA10MA063.pdf: 806269 bytes, checksum: d98ad588b52836b1be3fce9b0b39e24e (MD5) Previous issue date: 2010-12-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Embryo cryopreservation is an important tool that allows the storage of genetic material for long time, without loss of functional activity or genetic damage. Cryopreservation of in vivo-produced embryos is well established and provides similar results than those obtained after fresh embryos transfer. However, in vitro-produced (IVP) bovine embryos are easily damaged by conventional methods of cryopreservation, resulting in low survival rates after re-warming. Such sensitivity seems to be related to an excessive amount of lipid in the embryos cytoplasm during in vitro development. This might occur due to serum containing medium cultured embryos. Mechanical removal of lipid droplets can improve survival of early developmental stages embryos after cryopreservation. Nevertheless, delipidation method are laborious and time-consuming, besides altering embryo development after transfer to the recipients. Therefore, studies have searched for non invasive and less laborious techniques to reduce the amount of cytoplasmic lipids of bovine IVP embryos, thus improving their cryotolerance. Trans-10, cis-12 CLA, a conjugated isomer of linoleic can inhibit the fatty acid synthesis, thus decreasing the amount of lipid in several human and animal cells. It is known that lipid synthesis reduction involve down-regulation of mRNA expression of lipogenic enzymes associated with fat synthesis. Studies showed that addition of t10, c12 CLA to culture media, can reduce lipid content of bovine IVP embryos, improving their cryotolerance. Therefore, this study evaluated two CLA isomers on cryotolerance of IVP bovine embryos, as well as the enzymes acetyl-CoA carboxylase (ACCa), stearoyl-CoA desaturase (SCD1) and fatty acid synthase (FASN) mRNA expression of these embryos. In Experiment 1, embryos were cultured in media with increasing concentrations of trans-10, cis-12 CLA isomer: control group (0 μM), 50CLA group (50 μM), 100CLA group (100 μM) and 200CLA group (200 μM), looking for the higher concentration that does not negatively affect embryo development. In Experiment 2, zygotes were cultured in medium containing 100 μM (determined in Experiment 1) of different CLA isomers: control (CLA free) group, t10, c12 CLA group, c9, t11 CLA group and Mixture (50% c9, t11 CLA + 50% t10, c12) group. In Experiment 3, zygotes were allocated in 2 groups: CLA group, containing 100 μM of t10, c12 CLA isomer (determined in Experiment 2) and control (CLA free) group. Blastocysts were separated according to their stage (Bx or Bl) and subjected to vitrification or freezing. As viability criteria, cleavage and blastocyst rates were assessed after IVC and reexpanding and hatching rates were assessed after re-warming. Cell counting and mRNA expression of the ACCa, SCD1 and FASN enzymes were also assessed. The highest concentration of t10, c12 CLA that did not impair blastocyst rates was 100μM.In Experiment 2, the highest hatching rate after re-warming was obtained in c9, t11 group, vitrified at Bx stage (68.6%), not differing from the other treatments vitrified at this stage. The lowest hatching rate was obtained in Mixture group, vitrified at Bl stage (8.0%), not differing from the groups t10, c12 and c9, t11, vitrified at the same stage. In all treatments, Bx stage embryos showed higher viability than Bl stage embryos, except for the Control group, in whose the viability was similar. In Experiment 3, the highest hatching rate was obtained in Bx stage Control vitrified group (67.4%), which was similar to the Bx stage vitrified CLA group. The xv lowest hatching rate was observed in Bl stage frozen CLA group (10.3%), not differing from the other cryopreserved treatments at the same stage. In all frozen groups, despite CLA addition, hatching rates were all similar. There was also no difference in cell counting or mRNA expression of the enzymes ACCa, SCD1 and FASN, among embryos.Under the conditions of this study, the addition of CLA isomers t10, c12 and c9, t11 to culture media does not improve cryotolerance of IVP bovine embryos, and the isomer t10, c12 CLA does not influences the cell number and mRNA expression of enzymes ACCa, SCD1 and FASN / A criopreservação de embriões é uma importante ferramenta que permite o armazenamento de material genético por período prolongado, sem causar perda de atividade funcional ou alterações genéticas nessas estruturas. A criopreservação de embriões gerados in vivo está bem estabelecida e proporciona resultados muito próximos aos obtidos após a transferência de embriões frescos. Já os embriões bovinos produzidos in vitro (PIV) são extremamente sensíveis aos métodos convencionais de criopreservação, apresentando reduzidas taxas de sobrevivência após o reaquecimento. Essa sensibilidade parece estar relacionada ao acúmulo excessivo de lipídeos no citoplasma dos embriões durante o desenvolvimento in vitro, principalmente quando o cultivo é realizado em meios adicionados de soro. Estudos realizados com embriões em estágios iniciais de desenvolvimento evidenciaram que a remoção física das gotas lipídicas é capaz de aumentar a tolerância destes embriões à criopreservação. Contudo, o método de delipidação é demasiadamente trabalhoso e demorado, além de alterar o potencial de desenvolvimento dos embriões após a transferência para as receptoras. Dessa forma, os estudos têm buscado métodos não invasivos e menos trabalhosos, que reduzam a quantidade de lipídeos no citoplasma dos embriões bovinos PIV, melhorando assim a sua criotolerância. O trans-10, cis-12 CLA, um isômero conjugado do ácido linoleico, é capaz de inibir a síntese de ácidos graxos, diminuindo o teor lipídico em diversos tecidos de animais e humanos. Sabe-se que um dos mecanismos pelos quais este isômero exerce esse efeito é através da diminuição da expressão de RNAm de enzimas responsáveis pela síntese de lipídeos. Estudos mostraram que a adição do t10, c12 CLA ao meio de cultivo pode reduzir o acúmulo lipídico de embriões bovinos PIV, aumentando a sua criotolerância. Assim, este estudo teve como objetivo avaliar o efeito dos dois principais isômeros do CLA na criotolerância de embriões bovinos PIV e adicionalmente a expressão de RNAm das enzimas acetil-CoA carboxilase (ACCa), estearoil-CoA dessaturase (SCD1) e ácido graxo sintase (FASN) desses embriões. No Experimento 1, embriões foram cultivados em meio com concentrações crescentes do isômero t10, c12 CLA: grupo controle (0 μM), grupo 50CLA (50 μM), grupo 100CLA (100 μM) e grupo 200CLA (200 μM), buscando a maior concentração que não afete o posterior desenvolvimento embrionário. No Experimento 2, os zigotos foram cultivados em meio com 100 μM, (concentração apontada no Experimento 1) de diferentes isômeros de CLA, sendo: grupo controle, sem adição de CLA, grupo t10, c12 CLA, grupo c9, t11 CLA e grupo Mistura, com 50% de cada isômero. No Experimento 3, os zigotos foram distribuídos em 2 grupos: grupo CLA, contendo 100 μM do isômero t10, c12 CLA (determinado no Experimento 2) e grupo controle, sem CLA. Os blastocistos obtidos foram separados em função do estágio (Bx ou Bl) e submetidos ao processo de vitrificação ou congelamento. Como critérios de viabilidade foram avaliados as taxas de clivagem e de blastocistos após o cultivo, e de re-expansão e eclosão após o reaquecimento. Ainda, foi determinada a densidade celular e a expressão de RNAm das enzimas ACCa, SCD1 e FASN destes embriões. A maior concentração de t10, c12 CLA que não reduziu a taxa de blastocistos foi a de 100μM. No Experimento 2, a maior taxa de eclosão após o reaquecimento foi a do grupo c9, t11 vitrificado no estágio de Bx xiii (68,6%), que não diferiu dos demais tratamentos vitrificados neste estágio. A menor taxa de eclosão foi a do grupo Mistura (c9, t11 + t10, c12, no estágio de Bl (8,0%), que não diferiu dos grupos t10, c12 e c9, t11, vitrificados no mesmo estágio. Em todos os tratamentos, embriões em estágio de Bx apresentaram taxas superiores aos Bl, com exceção do grupo Controle, cujas taxas foram similares. No Experimento 3, a maior taxa de eclosão foi observada no grupo Controle com Bx vitrificados (67,4%), que não diferiu do grupo CLA, com Bx vitrificados. A menor taxa de eclosão foi a do grupo CLA com Bl congelados (10,3%), que não diferiu dos demais tratamentos criopreservados neste estágio. Nos grupos submetidos ao congelamento, as taxas de desenvolvimento foram semelhantes, independente da exposição ao CLA. Não houve diferença na densidade celular entre os embriões expostos ou não ao t10, c12 CLA, e nem na expressão de RNAm das enzimas ACCa, SCD1 e FASN. Conclui-se que nas condições deste estudo a adição dos isômeros do CLA t10, c12 e c9, t11 ao meio de cultivo não melhora a criotolerância de embriões bovinos PIV, bem como que o isômero t10, c12 CLA, não interfere na densidade celular e na expressão de RNAm das enzimas ACCa, SCD1 e FASN destes embriões

Submitted by Automação e Estatística (sst@bczm.ufrn.br) on 2018-05-03T00:00:27Z No. of bitstreams: 1 CarolinneThaisaDeOliveiraFernandes_DISSERT.pdf: 3269390 bytes, checksum: bb738a2d3cb64377a7b4570771ea082c (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2018-05-08T21:51:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 CarolinneThaisaDeOliveiraFernandes_DISSERT.pdf: 3269390 bytes, checksum: bb738a2d3cb64377a7b4570771ea082c (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-08T21:51:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CarolinneThaisaDeOliveiraFernandes_DISSERT.pdf: 3269390 bytes, checksum: bb738a2d3cb64377a7b4570771ea082c (MD5) Previous issue date: 2018-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / As vitaminas antioxidantes, alfa-tocoferol e o retinol, assim como a expressão de RNAm de possíveis genes candidatos, foram associados ao risco de DCV. Em um estudo realizado anteriormente por nosso grupo de pesquisa foi sugerido que 13 genes são diferentemente expressos em pacientes com síndrome coronariana aguda. Neste trabalho, objetivou-se investigar o perfil sérico destas vitaminas e a expressão de genes candidatos em leucócitos sanguíneos de pacientes de acordo com a extensão da lesão da artéria coronária. Foram selecionados pacientes com doença arterial coronariana (n = 177), idade entre 30 e 74 anos e submetidos a angiografia coronária eletiva. A extensão da lesão coronária foi avaliada pelo índice de Friesinger, o qual foi dividido em três categorias: 0-4, 5-9 e 10-15. Os níveis séricos de alfa-tocoferol e retinol foram determinados por cromatografia líquida de alta performance (HPLC). A expressão de RNAm dos genes ALOX15, AREG, BCL2A1, BCL2L1, CA1, COX7B, ECHDC3, IL18R1, IRS2, KCNE1, MMP9, MYL4 e TREML4 foram analisadas por RT-qPCR. O nível de alfa-tocoferol foi menor no grupo 0-4 em comparação com o grupo 5-9 (p=0,035) e mostrou uma correlação positiva com os genes BCL2A1, COX7B e correlação negativa com o ECHDC3. O RNAm do gene ECHDC3 foi menos expresso enquanto que o RNAm dos genes AREG, BCL2A1, COX7B, IL18R1 e TREML4 foram mais expressos em pacientes do grupo 10-15 comparados ao grupo 0-4 (p<0,05). Além disso, o RNAm dos genes BCL2A1, BCL2L1 e MYL4 foram mais expressos em pacientes do grupo 5-9 do que no grupo 0-4 (p<0,05). Não foi observada associação entre o nível sérico de retinol e a extensão da lesão coronária ou expressão de RNAm dos genes candidatos. Níveis mais altos de alfatocoferol em pacientes com lesões mais extensas das artérias coronárias demonstra possivelmente uma alteração no metabolismo da vitamina E enquanto que a regulação positiva na expressão de RNAm dos genes AREG, BCL2A1, COX7B, IL18R1 e TREML4 é influenciada pela extensão das lesões das artérias coronárias mais graves. Os resultados desse estudo sugerem um potencial uso do RNAm desses genes como biomarcadores da expressão gênica para avaliar a progressão da DAC. / The antioxidant vitamin, alpha-tocopherol and retinol, as well as the mRNA expression of possible candidate genes, were associated with the risk of CVD. In a previous study by our research group it was suggested that 13 genes are differentially expressed in patients with acute coronary syndrome. Here we aimed to investigate the serum profile of these vitamins and the expression of candidate genes in blood leukocytes from patients according to the extent of coronary artery lesion. Coronary artery disease patients (n = 177), aged 30-74 years and undergoing elective coronary angiography were selected. The extent of the coronary lesion was assessed using the Friesinger index, which was divided into three categories: 0-4, 5-9 and 10-15. Serum levels of alpha-tocopherol and retinol were determined by high performance liquid chromatography (HPLC). Leukocyte mRNA expression of ALOX15, AREG, BCL2A1, BCL2L1, CA1, COX7B, ECHDC3, IL18R1, IRS2, KCNE1, MMP9, MYL4 and TREML4 were analyzed by RT-qPCR. Alpha-tocopherol level was lower in the 0-4 group compared to the 5-9 group (p=0.035) and showed a positive correlation with BCL2A1 and COX7B mRNA expression and negative correlation with ECHDC3 mRNA expression. ECDHC3 mRNA expression was downregulated, whereas the mRNA expression of AREG, BCL2A1, COX7B, IL18R1, and TREML4 was upregulated in 10-15 group as compared with 0- 4 group (p<0.05). The mRNA expression of BCL2A1, BCL2L1, and MYL4 was upregulated in FI 5-9 group as compared with 0-4 group (p<0.05). No association was observed between serum level of retinol and the extent of coronary lesion or mRNA expression of the candidate genes. Higher levels of alpha-tocopherol in patients with more extensive coronary artery lesions may show a change in vitamin E metabolism while positive regulation of mRNA expression of AREG, BCL2A1, COX7B, IL18R1 and TREML4 genes is influenced by the extent of lesions of the most severe coronary arteries. The results of this study suggest a potential use of the mRNA of these genes as biomarkers of gene expression to evaluate the progression of CAD.

A metionina é doadora de grupos metil para metilação do DNA, processo responsável por modificações da expressão gênica. Diante da importância da metionina para o crescimento e desenvolvimento normais, variações desse aminoácido na dieta podem alterar a estabilidade do DNA. O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito de dietas deficiente e suplementada em metionina sobre a instabilidade genômica e o estresse oxidativo em camundongos e suas mães tratadas durante gestação e lactação e destas também foi realizada a expressão de RNAm de Mat1a, Bhmt e Cbsdas vias de transmetilação, remetilação e transsulfuração da metionina, respectivamente, em fígado. As fêmeas foram divididas nos grupos de dietas de metionina (controle, 0,3% DL-metionina; suplementado, 2,0%; e deficiente 0%) até o fim da lactação (10 semanas) e, para cada grupo de fêmeas, os filhotes foram subdivididos e também receberam essas dietas durante 18 semanas após desmame. Foram avaliados o consumo de ração, massa corpórea e massa relativa de fígado e rinse a taxa de sobrevivência dos filhotes. Também foram realizadas a avaliação da peroxidação lipídica (quantificação das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, TBARS), da quantificação de glutationa (GSH)e da atividade da catalase, da instabilidade genômica (ensaio do cometa) e a análise do RNAm deMat1a, BhmteCbs somente em fígado das fêmeas. A dieta deficiente resultou em menor consumo de ração e massa corpórea em ambas fases e reduziu a sobrevivência dos filhotes que receberam essa dieta.A suplementação reduziu a concentração de TBARS nas fêmeas em ambos tecidos e a deficiência não diferiu. Nos filhotes, a suplementação reduziu a concentração de TBARS em fígado, enquanto que a deficiência aumentou. A suplementação aumentou a concentração de GSH em fígado das fêmeas, assim como a deficiência em rins. Nos filhotes, houve uma inversão de respostas, ou seja, a suplementação reduziu a concentração de GSH em fígado, assim como a deficiência, também observada em rins. Não houve diferença na catalase das fêmeas, mas houve redução em ambos tecidos dos filhotes. A suplementação e a deficiência reduziram os danos ao DNA hepático das fêmeas, mas em rins a suplementação aumentou e a deficiência reduziu. Nos filhotes, a suplementação e a deficiência aumentaram os danos ao DNA em ambos tecidos. A suplementação de metionina em fêmeas não alterou a expressão dos RNAm avaliados e a deficiência reduziu em Cbs somente. Concluiu-se que na fase materna, a suplementação ou a deficiência de metionina não resultou em estresse oxidativo, mas a suplementação reduziu a instabilidade genômica no fígado e aumentou no rim. A deficiência resultou em menor instabilidade nos dois tecidos. Na fase descendente, a suplementação e a deficiência de metionina apresentaram variação de estresse oxidativo em ambos tecidos e também resultaram em maior instabilidade genômica. / Methionine is the main methyl donor for the DNA methylation, a process responsible for gene expression modifications. Since this essential amino acid is required for normal growth and development, variations of this compound in the diet may lead to alterations on DNA stability. Thus, this study aimed to evaluate the effect of deficient and supplemented methionine diets on oxidative stress and genomic instability in mice and their dams treated during pregnancy and lactation, and the expression of Mat1a, Bhmt and Cbs mRNA of transmethylation, remetthylation, and transulfuration pathways, respectively, in dams livers. The dams were divided into three methionine diets groups (control, 0,3% DL-methionine; supplemented, 2,0%; and deficient, 0%) until the end of lactation (10 weeks). For each dams groups, the offspring were subdivided and were also treated with the same diets during 18 weeks after weaning. The parameters evaluated were food intake, body weight, relative liver and kidney weights, and survival of the offspring. Also, it was carried out theevaluation of lipid peroxidation (thiobarbituric acid reactive substances, TBARS), quantification of glutathione (GSH) and catalase activity, and genomic instability (comet assay) in liver and kidneys; andMat1a, Bhmt, and CbsmRNA analysis only in dams liver. The deficient diet resulted in lower food intake and body weights in both phases and reduced the survival of the offspring that were treated with this diet. The supplemented diet reduced the TBARS concentration in both tissues of dams and the deficient diet did not differ. In the offspring, the supplementation reduced liver TBARS, whereas the deficiency raised. The supplementation increased the liver GSH concentration of dams, as well as the deficiency in kidneys. In the offspring, the responses were different; the supplementation reduced the liver GSH, as well as the deficiency, also observed in kidneys. There were no differences of catalase parameter of dams, but there was a reduction in both tissues of the offspring. Both supplementation and deficiency reduced the liver DNA damage of dams, however the supplementation increased and the deficiency reduced the DNA damage of kidneys. In the offspring, both diets increased the DNA damage in both tissues. The methionine supplementation did not differ the mRNA expression and the deficiency only reduced the Cbs, mRNA expression. It was concluded that the methionine supplementation or deficiency did not resulted in oxidative stress in dams, but the supplementation reduced the genomic instability of liver and raised the kidney one. The deficiency resulted in lower genomic instability in both tissues in dams. In the offspring, both methionine supplementation and deficiency presented variation of oxidative stress in both tissues and resulted more genomic instability.

A metionina é doadora de grupos metil para metilação do DNA, processo responsável por modificações da expressão gênica. Diante da importância da metionina para o crescimento e desenvolvimento normais, variações desse aminoácido na dieta podem alterar a estabilidade do DNA. O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito de dietas deficiente e suplementada em metionina sobre a instabilidade genômica e o estresse oxidativo em camundongos e suas mães tratadas durante gestação e lactação e destas também foi realizada a expressão de RNAm de Mat1a, Bhmt e Cbsdas vias de transmetilação, remetilação e transsulfuração da metionina, respectivamente, em fígado. As fêmeas foram divididas nos grupos de dietas de metionina (controle, 0,3% DL-metionina; suplementado, 2,0%; e deficiente 0%) até o fim da lactação (10 semanas) e, para cada grupo de fêmeas, os filhotes foram subdivididos e também receberam essas dietas durante 18 semanas após desmame. Foram avaliados o consumo de ração, massa corpórea e massa relativa de fígado e rinse a taxa de sobrevivência dos filhotes. Também foram realizadas a avaliação da peroxidação lipídica (quantificação das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, TBARS), da quantificação de glutationa (GSH)e da atividade da catalase, da instabilidade genômica (ensaio do cometa) e a análise do RNAm deMat1a, BhmteCbs somente em fígado das fêmeas. A dieta deficiente resultou em menor consumo de ração e massa corpórea em ambas fases e reduziu a sobrevivência dos filhotes que receberam essa dieta.A suplementação reduziu a concentração de TBARS nas fêmeas em ambos tecidos e a deficiência não diferiu. Nos filhotes, a suplementação reduziu a concentração de TBARS em fígado, enquanto que a deficiência aumentou. A suplementação aumentou a concentração de GSH em fígado das fêmeas, assim como a deficiência em rins. Nos filhotes, houve uma inversão de respostas, ou seja, a suplementação reduziu a concentração de GSH em fígado, assim como a deficiência, também observada em rins. Não houve diferença na catalase das fêmeas, mas houve redução em ambos tecidos dos filhotes. A suplementação e a deficiência reduziram os danos ao DNA hepático das fêmeas, mas em rins a suplementação aumentou e a deficiência reduziu. Nos filhotes, a suplementação e a deficiência aumentaram os danos ao DNA em ambos tecidos. A suplementação de metionina em fêmeas não alterou a expressão dos RNAm avaliados e a deficiência reduziu em Cbs somente. Concluiu-se que na fase materna, a suplementação ou a deficiência de metionina não resultou em estresse oxidativo, mas a suplementação reduziu a instabilidade genômica no fígado e aumentou no rim. A deficiência resultou em menor instabilidade nos dois tecidos. Na fase descendente, a suplementação e a deficiência de metionina apresentaram variação de estresse oxidativo em ambos tecidos e também resultaram em maior instabilidade genômica. / Methionine is the main methyl donor for the DNA methylation, a process responsible for gene expression modifications. Since this essential amino acid is required for normal growth and development, variations of this compound in the diet may lead to alterations on DNA stability. Thus, this study aimed to evaluate the effect of deficient and supplemented methionine diets on oxidative stress and genomic instability in mice and their dams treated during pregnancy and lactation, and the expression of Mat1a, Bhmt and Cbs mRNA of transmethylation, remetthylation, and transulfuration pathways, respectively, in dams livers. The dams were divided into three methionine diets groups (control, 0,3% DL-methionine; supplemented, 2,0%; and deficient, 0%) until the end of lactation (10 weeks). For each dams groups, the offspring were subdivided and were also treated with the same diets during 18 weeks after weaning. The parameters evaluated were food intake, body weight, relative liver and kidney weights, and survival of the offspring. Also, it was carried out theevaluation of lipid peroxidation (thiobarbituric acid reactive substances, TBARS), quantification of glutathione (GSH) and catalase activity, and genomic instability (comet assay) in liver and kidneys; andMat1a, Bhmt, and CbsmRNA analysis only in dams liver. The deficient diet resulted in lower food intake and body weights in both phases and reduced the survival of the offspring that were treated with this diet. The supplemented diet reduced the TBARS concentration in both tissues of dams and the deficient diet did not differ. In the offspring, the supplementation reduced liver TBARS, whereas the deficiency raised. The supplementation increased the liver GSH concentration of dams, as well as the deficiency in kidneys. In the offspring, the responses were different; the supplementation reduced the liver GSH, as well as the deficiency, also observed in kidneys. There were no differences of catalase parameter of dams, but there was a reduction in both tissues of the offspring. Both supplementation and deficiency reduced the liver DNA damage of dams, however the supplementation increased and the deficiency reduced the DNA damage of kidneys. In the offspring, both diets increased the DNA damage in both tissues. The methionine supplementation did not differ the mRNA expression and the deficiency only reduced the Cbs, mRNA expression. It was concluded that the methionine supplementation or deficiency did not resulted in oxidative stress in dams, but the supplementation reduced the genomic instability of liver and raised the kidney one. The deficiency resulted in lower genomic instability in both tissues in dams. In the offspring, both methionine supplementation and deficiency presented variation of oxidative stress in both tissues and resulted more genomic instability.

Com o início da fortificação de farinhas com ácido fólico (AF) no Brasil, a partir 2004, a população passou a estar exposta de modo compulsório a maiores quantidades desta vitamina. Sabe-se que o AF na sua forma sintética pode não ser completamente convertido para formas metabolicamente ativas, levando ao aparecimento de uma fração não metabolizada no organismo. Este fato é mais preocupante nos indivíduos que além da fortificação, fazem uso terapêutico dessa vitamina, como em pacientes com anemias hemolíticas (esferocitose hereditária (EH), &#946;-talassemia heterozigótica (&#946;-TH), entre outras). O objetivo desse estudo foi avaliar se as concentrações séricas de AF não metabolizado (UMFA) afetam a metilação global do DNA; a expressão de RNAm de genes da DHFR, MTHFR, interferon-&#947;, TNF-&#945; e interleucina (IL)-8; e a citotoxicidade de células NK. Foram incluídos 27 pacientes com EH, 50 indivíduos com &#946;-talassemia heterozigótica (&#946;-TH) e 136 indivíduos saudáveis. Outros 30 indivíduos saudáveis foram incluídos num estudo de intervenção com 5mg/dia de AF durante 90 dias. Foram realizadas as análises de: ácido fólico sérico, eritrocitário e UMFA, vitamina B12, homocisteína total; expressões de RNAm dos genes de MTHFR, DHFR, IFN-&#947;, TNF-&#945; e IL-8; citotoxicidade das células NK; metilação global do DNA e citocinas séricas IL6, IL-8, IL10, IFN-&#947; e TNF-&#945;. Resultados: Os pacientes EH apresentaram maiores concentrações de AF (sérico, eritrocitário e UMFA) que seus controles, sendo que 55,5% (método microbiológico) e 74,1% (método LC-MS/MS) apresentaram concentrações suprafisiológicas da vitamina, e 74,1% apresentaram concentrações aumentadas de UMFA. No grupo &#946;-TH foi observado maiores concentrações de folato eritrocitário comparado ao controle e 22% dos indivíduos tinham concentrações suprafisiológicas de AF. No estudo de intervenção, após 45 e 90 dias de uso de AF as concentrações suprafisiológicas estavam presentes em 93,3% dos indivíduos e 100% deles apresentavam concentrações aumentadas de UMFA. Não foram observadas diferenças nas taxas de metilação global do DNA entre os grupos EH e &#946;-TH quando comparados aos seus controles e não foi verificada correlação entre metilação global e concentrações de UMFA. Tanto EH quanto &#946;-TH apresentaram maior expressão de RNAm de IL-8, quando comparados aos seus controles. No grupo de intervenção houve maior expressão de IL-8 após 45 dias de uso de AF quando comparado ao período pré-intervenção. Foi mostrada uma correlação inversa entre as concentrações de folato eritrocitário com o número de células NK no grupo EH e com a capacidade citotóxica das células NK no grupo total (EH + controle). No grupo intervenção foi observado menor número e menor capacidade citotóxica das células NK após 90 dias de uso de AF. Conclusões: O uso de AF 5mg/dia foi associado com aumento expressivo das concentrações de folato sérico, eritrocitário, UMFA, na expressão de RNAm de genes da citocina inflamatória IL-8 e redução do número e da citotoxicidade das células NK. Dessa forma, altas doses de AF podem resultar em alterações de componentes do sistema imune podendo prejudicar os mecanismos de vigilância celular das células NK. Os nossos achados sugerem que é importante o acompanhamento terapêutico dos pacientes que fazem uso de AF, especialmente aqueles indivíduos que fazem uso crônico desta vitamina por longo tempo, como os pacientes com anemias hemolíticas, mulheres que desejam engravidar e gestantes. / With the beginning of the fortification of flour with folic acid (FA) in Brazil, since 2004, the population has been exposed compulsorily to larger amounts of this vitamin. It is known that FA in its synthetic form can not be completely converted to metabolically active forms, leading to the appearance of an unmetabolized fraction in the body. This fact is more worrying in subjects beyond fortification, make therapeutic use of this vitamin, such as patients with hemolytic anemia (hereditary spherocytosis (HS), &#946;-thalassemia heterozygotic (&#946;-TH), among others). The aim of this study was to evaluate if serum concentrations of unmetabolized FA (UMFA) affect the global DNA methylation; mRNA expression of DHFR, MTHFR, interferon-&#947;, TNF-&#945; and interleukin (IL)-8 genes; and on cytotoxicity of NK cells. It was included 27 patients EH, 50 subjects &#946;-TH and 136 healthy subjects. Another 30 healthy subjects were included in an intervention study with 5 mg/FA daily during 90 days. Analyzes performed were: serum and erythrocyte folate, and UMFA, vitamin B12, tHcy; mRNA expression of MTHFR, DHFR, IFN-&#947;, TNF-&#945; and IL-8 genes; cytotoxicity of NK cells; global DNA methylation and serum cytokines IL6, IL-8, IL10, IFN-&#947; and TNF-&#945;. Results: EH patients presented higher FA concentrations (serum, erythrocytes and UMFA) than controls ones, and 55.5% (microbiologic method) and 74.1% (LC-MS/MS method) showed supraphysiologic concentrations of vitamin, and 74.1% presented increased concentrations of UMFA. In &#946;-TH group, it was observed higher erythrocyte folate concentrations compared with the control and 22% of subjects had supraphysiological concentrations of FA. In the intervention study, after 45 and 90 days of FA use, supraphysiological concentrations were present in 93.3% of subjects and 100% of them showed increased concentrations of UMFA. It was not observed differences in global methylation of DNA between EH and &#946;-TH groups when compared to their controls and it was not observed significant correlation between global DNA methylation and UMFA levels. Both EH and &#946;-TH showed higher mRNA expression of IL-8 gene, when compared to controls. In the intervention group, there was higher mRNA expression of IL-8 gene after 45 days of FA use when compared to pre-intervention period. It was demonstrated an inverse correlation between erythrocyte folate levels and the number of NK cells in EH group; and cytotoxic capacity of NK cells on total group (EH + control). In intervention group, it was observed fewer number and lower cytotoxic capacity of NK cells after 90 days of AF use. Conclusions: The use of AF 5mg daily was associated with a significant increase in serum and erythrocytes folate levels, accompanied by increase in UMFA levels, an increase in mRNA expression of IL-8 gene, and reduction of the number and the cytotoxicity capacity of NK cells. Thus, high doses of AF can result in modifications of the immune system components, which may damage the cell surveillance mechanisms of NK cells. Our findings suggest that is important the therapeutic follow up of patients that are using AF, especially those subjects with chronic use of this vitamin, such as patients with hemolytic anemia, women who wish to become pregnant and pregnant women.

Com o início da fortificação de farinhas com ácido fólico (AF) no Brasil, a partir 2004, a população passou a estar exposta de modo compulsório a maiores quantidades desta vitamina. Sabe-se que o AF na sua forma sintética pode não ser completamente convertido para formas metabolicamente ativas, levando ao aparecimento de uma fração não metabolizada no organismo. Este fato é mais preocupante nos indivíduos que além da fortificação, fazem uso terapêutico dessa vitamina, como em pacientes com anemias hemolíticas (esferocitose hereditária (EH), &#946;-talassemia heterozigótica (&#946;-TH), entre outras). O objetivo desse estudo foi avaliar se as concentrações séricas de AF não metabolizado (UMFA) afetam a metilação global do DNA; a expressão de RNAm de genes da DHFR, MTHFR, interferon-&#947;, TNF-&#945; e interleucina (IL)-8; e a citotoxicidade de células NK. Foram incluídos 27 pacientes com EH, 50 indivíduos com &#946;-talassemia heterozigótica (&#946;-TH) e 136 indivíduos saudáveis. Outros 30 indivíduos saudáveis foram incluídos num estudo de intervenção com 5mg/dia de AF durante 90 dias. Foram realizadas as análises de: ácido fólico sérico, eritrocitário e UMFA, vitamina B12, homocisteína total; expressões de RNAm dos genes de MTHFR, DHFR, IFN-&#947;, TNF-&#945; e IL-8; citotoxicidade das células NK; metilação global do DNA e citocinas séricas IL6, IL-8, IL10, IFN-&#947; e TNF-&#945;. Resultados: Os pacientes EH apresentaram maiores concentrações de AF (sérico, eritrocitário e UMFA) que seus controles, sendo que 55,5% (método microbiológico) e 74,1% (método LC-MS/MS) apresentaram concentrações suprafisiológicas da vitamina, e 74,1% apresentaram concentrações aumentadas de UMFA. No grupo &#946;-TH foi observado maiores concentrações de folato eritrocitário comparado ao controle e 22% dos indivíduos tinham concentrações suprafisiológicas de AF. No estudo de intervenção, após 45 e 90 dias de uso de AF as concentrações suprafisiológicas estavam presentes em 93,3% dos indivíduos e 100% deles apresentavam concentrações aumentadas de UMFA. Não foram observadas diferenças nas taxas de metilação global do DNA entre os grupos EH e &#946;-TH quando comparados aos seus controles e não foi verificada correlação entre metilação global e concentrações de UMFA. Tanto EH quanto &#946;-TH apresentaram maior expressão de RNAm de IL-8, quando comparados aos seus controles. No grupo de intervenção houve maior expressão de IL-8 após 45 dias de uso de AF quando comparado ao período pré-intervenção. Foi mostrada uma correlação inversa entre as concentrações de folato eritrocitário com o número de células NK no grupo EH e com a capacidade citotóxica das células NK no grupo total (EH + controle). No grupo intervenção foi observado menor número e menor capacidade citotóxica das células NK após 90 dias de uso de AF. Conclusões: O uso de AF 5mg/dia foi associado com aumento expressivo das concentrações de folato sérico, eritrocitário, UMFA, na expressão de RNAm de genes da citocina inflamatória IL-8 e redução do número e da citotoxicidade das células NK. Dessa forma, altas doses de AF podem resultar em alterações de componentes do sistema imune podendo prejudicar os mecanismos de vigilância celular das células NK. Os nossos achados sugerem que é importante o acompanhamento terapêutico dos pacientes que fazem uso de AF, especialmente aqueles indivíduos que fazem uso crônico desta vitamina por longo tempo, como os pacientes com anemias hemolíticas, mulheres que desejam engravidar e gestantes. / With the beginning of the fortification of flour with folic acid (FA) in Brazil, since 2004, the population has been exposed compulsorily to larger amounts of this vitamin. It is known that FA in its synthetic form can not be completely converted to metabolically active forms, leading to the appearance of an unmetabolized fraction in the body. This fact is more worrying in subjects beyond fortification, make therapeutic use of this vitamin, such as patients with hemolytic anemia (hereditary spherocytosis (HS), &#946;-thalassemia heterozygotic (&#946;-TH), among others). The aim of this study was to evaluate if serum concentrations of unmetabolized FA (UMFA) affect the global DNA methylation; mRNA expression of DHFR, MTHFR, interferon-&#947;, TNF-&#945; and interleukin (IL)-8 genes; and on cytotoxicity of NK cells. It was included 27 patients EH, 50 subjects &#946;-TH and 136 healthy subjects. Another 30 healthy subjects were included in an intervention study with 5 mg/FA daily during 90 days. Analyzes performed were: serum and erythrocyte folate, and UMFA, vitamin B12, tHcy; mRNA expression of MTHFR, DHFR, IFN-&#947;, TNF-&#945; and IL-8 genes; cytotoxicity of NK cells; global DNA methylation and serum cytokines IL6, IL-8, IL10, IFN-&#947; and TNF-&#945;. Results: EH patients presented higher FA concentrations (serum, erythrocytes and UMFA) than controls ones, and 55.5% (microbiologic method) and 74.1% (LC-MS/MS method) showed supraphysiologic concentrations of vitamin, and 74.1% presented increased concentrations of UMFA. In &#946;-TH group, it was observed higher erythrocyte folate concentrations compared with the control and 22% of subjects had supraphysiological concentrations of FA. In the intervention study, after 45 and 90 days of FA use, supraphysiological concentrations were present in 93.3% of subjects and 100% of them showed increased concentrations of UMFA. It was not observed differences in global methylation of DNA between EH and &#946;-TH groups when compared to their controls and it was not observed significant correlation between global DNA methylation and UMFA levels. Both EH and &#946;-TH showed higher mRNA expression of IL-8 gene, when compared to controls. In the intervention group, there was higher mRNA expression of IL-8 gene after 45 days of FA use when compared to pre-intervention period. It was demonstrated an inverse correlation between erythrocyte folate levels and the number of NK cells in EH group; and cytotoxic capacity of NK cells on total group (EH + control). In intervention group, it was observed fewer number and lower cytotoxic capacity of NK cells after 90 days of AF use. Conclusions: The use of AF 5mg daily was associated with a significant increase in serum and erythrocytes folate levels, accompanied by increase in UMFA levels, an increase in mRNA expression of IL-8 gene, and reduction of the number and the cytotoxicity capacity of NK cells. Thus, high doses of AF can result in modifications of the immune system components, which may damage the cell surveillance mechanisms of NK cells. Our findings suggest that is important the therapeutic follow up of patients that are using AF, especially those subjects with chronic use of this vitamin, such as patients with hemolytic anemia, women who wish to become pregnant and pregnant women.