As CDKs 9 e 11 fazem parte da subfamília de CDKs transcricionais, e portanto desempenham papéis de controle na dinâmica atividade de síntese e processamento do RNA mensageiro pela RNA Polimerase II. Devido à sua capacidade de modular individualmente a atividade dos complexos de transcrição da RNAP II, estas quinases assumem uma grande importância para a regulação da expressão gênica em células eucarióticas. Casos de desregulação da atividade de CDKs transcricionais têm sido frequentemente relacionados a diversas patologias humanas graves, incluindo vários tipos de câncer e também a AIDS (em razão do papel essencial desempenhado pela CDK9 na replicação do HIV. O objetivo deste trabalho é a obtenção das CDKs humanas 9 e 11 através da expressão heteróloga em Escherichia coli, buscando o aperfeiçoamento de métodos para produzir estas enzimas em quantidade e pureza suficientes para aplicação em estudos estruturais. A utilização de um sistema bacteriano oferece muitas vantagens práticas, como a simplicidade da técnica, baixo custo, altos níveis de expressão, e elevado rendimento na purificação do produto. No entanto, a obtenção de quinases humanas ativas a partir de E. coli sempre representou um desafio experimental, devido aos problemas comumente associados à expressão heteróloga. Os resultados apresentados aqui demonstram a possibilidade de se obter a CDK9 humana enzimaticamente ativa pelo reenovelamento in vitro da proteína expressa pela bactéria na forma de corpos de inclusão, após etapas de solubilização e purificação em condições desnaturantes. Por outro lado, a CDK11 humana só pôde ser obtida em uma versão encurtada, consistindo apenas no seu domínio quinase, devido à forte inibição que um trecho N-terminal da sequência mostrou exercer sobre a expressão da proteína. Assim, este trabalho fornece exemplos de como é possível superar algumas das adversidades comuns da expressão heteróloga a fim de se obter CDKs humanas ativas empregando o sistema bacteriano. / CDK9 and CDK11 are members of the subfamily of transcriptional CDKs and therefore play central roles in the control of the dynamic activity of messenger RNA synthesis and processing by RNA polymerase II. Because of their ability to individually modulate the activity of RNAP II transcription complexes, these kinases are of great importance for the regulation of gene expression in eukaryotic cells. Several cases of deregulation of the transcriptional CDKs have been linked to important human diseases, including various types of cancer and also AIDS (due to the essential role of CDK9 in HIV replication). The objective of this work is to obtain human CDK9 and CDK11 heterologously expressed in Escherichia coli, seeking improved methods to produce these enzymes in quantity and purity suitable for structural studies. A bacterial system offers many practical advantages to protein production, such as technical simplicity, low costs, high levels of expression and high purification yield. However, it has always been an experimental challenge to obtain active human kinases from E. coli, because of the problems commonly associated with heterologous expression. The results presented here demonstrate the possibility of obtaining the enzymatically active human CDK9 by in vitro refolding of the protein expressed as bacterial inclusion bodies, after its solubilization and purification under denaturing conditions. Human CDK11, on the other hand, could only be obtained in a shortened form consisting just of its kinase domain, due to the strong inhibition that an N-terminal stretch exerts on the protein\'s own expression. Therefore, this work provides examples of how it is possible to overcome some of the common adversities of heterologous expression in order to obtain active human CDKs through the bacterial system.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-16062015-091524 |
| Date | 17 April 2015 |
| Creators | Níkolas Paparidis Ferreira dos Santos |
| Contributors | Fernanda Canduri, Andrei Leitão |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Química, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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