Made available in DSpace on 2016-02-26T13:34:39Z (GMT). No. of bitstreams: 2
melise_silveira_ioc_mest_2014.pdf: 2936486 bytes, checksum: f73183e180b237b1d6dc63c0c0afa155 (MD5)
license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5)
Previous issue date: 2016-02-23 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O surgimento de bactérias Gram-negativas resistentes à drogas tem sido progressivo e alarmante. Entre os patógenos de particular importância está Pseudomonas aeruginosa multirresistentes à drogas (MDR). Um clone epidêmico de P. aeruginosa MDR produtor da metalo-\03B2-lactamase SPM-1, chamado clone SP (ST277), tem sido encontrado em diferentes estados brasileiros. O gene blaSPM-1 foi descrito em uma estrutura genética chamada ISCR4, responsável pela sua mobilização e expressão. Além do gene blaSPM-1, tem sido descrito, neste clone, a presença de um integron de classe I carreando genes de resistência (In163) e um elemento genético ISCR14 carreando uma metilase de RNAr 16S (rmtD), que confere resistência a altas concentrações de aminoglicosídeos. Este tipo de associação resulta em um perfil de resistência extremamente preocupante. Assim, este estudo teve como objetivo investigar a contexto genético dos genes blaSPM-1 e rmtD, além de caracterizar mutações em genes cromossomais associados a multirresistência a antimicrobianos em amostras de P. aeruginosa pertencentes ao clone ST277, através de Sourthen blot e sequenciamento de nova geração. A partir de 50 amostras de P. aeruginosa MDR isoladas entre 2007 e 2010, foram selecionadas 13 amostras pertencentes ao ST277 (através de MLST) que apresentaram positividade para blaSPM-1 e/ou rmtD e In163 (através de PCR), sendo 12 do clone SP (A) e uma de um clone diferente, M, através de PFGE. Através de restrição do DNA com as enzimas de restrição SpeI e XbaI, e posterior hibridação com sondas dos genes alvos (blaSPM-1, rmtD e In163) foi possível observar que os genes alvos encontravam-se em fragmentos distintos e que a amostra do clone M apresentou um perfil de hibridação diferentes das demais amostras demonstrando a ocorrência de vários rearranjos na mesma, indicando uma maior distância evolutiva
A partir destes resultados, selecionamos 6 amostras para sequenciamento total do genoma utilizando a plataforma de sequenciamento MiSeq da Illumina. Através de sucessivas análises - que incluíram os contigs gerados na montagem de novo, montagens por referência e alinhamentos par a par- chegamos a uma região de 239.648pb onde estavam contidos o In163 e o ISCR14 carreando rmtD, inseridos em uma ilha genômica incorporada ao cromossomo bacteriano. O gene blaSPM-1 inserido no ISCR4 foi encontrado em uma região de 13.959pb, que incluía genes relacionados a plasmídios e transposons, contudo ainda não sabemos se esse elemento está incorporado ao cromossomo, ou livre em forma de plasmídio. Através da análise das mutações em genes cromossômicos associados a resistência à antimicrobianos, encontramos mutações nos genes oprD, ampD, mexZ, mexS, mexT, gyrA e parC que foram comuns às 6 amostras sequenciadas do ST277. Isso explicaria o fenótipo MDR nas amostras negativas para rmtD e/ou blaSPM-1. Além disso, como estas amostras foram isoladas em estados e anos distintos, acreditamos que essas mutações sejam características do ST277, o que pode ser um dos fatores associados a distribuição epidêmica deste clone no Brasil / The development of antimicrobial resistance among Gram
-
negative pathogens has been
progressive and relentless. A pathogen of particular concern is multidrug
-
resistant (MDR)
Pseudomonas aeruginosa
. An epidemic clone of MDR
P. aeruginosa
producing the metall
o
-
β
-
lactamase SPM
-
1, named SP clone (ST277), has been found in different Brazilian states.
The
bla
SPM
-
1
gene has been described in a genetic structure called ISCR4, responsible for its
mobilization and expression. Besides the
bla
SPM
-
1
gene, it has been des
cribed in this clone, a
classe I integron (In163) carrying resistance genes and the genetic element ISCR14 carrying a
16S rRNA metilase (
rmtD
), that confers resistance to high concentrations of aminoglycosides.
This kind of association results in an extrem
ely worrisome profile of resistance. Thus, this
work aimed to investigate the genetic background of
bla
SPM
-
1
and
rmtD
genes and to
characterize mutations in chromosomal genes associated with multidrug resistance in
P.
aeruginosa
isolates belonging to ST277 clone, using Sourthen blot and next
-
generation
sequencing. From 50 MDR
P. aeruginosa
isolates recovered from 2007 to 2010,there were
selected 13
bla
SPM
-
1
and
/or
rmtD
-
positive isolates (by PCR) belonging to ST277 (by MLST),
12 f
rom SP (A) clone and one from a different PFGE clone (M). By DNA digestion with
Spe
I
and
Xba
I restriction enzymes, and subsequent hybridization with probes for target genes
(
bla
SPM
-
1
,
rmtD
and
In163
),
it
was observed that the target genes were in separate
fragments,
and that the M clone isolate showed a different profile compared with the other isolates,
indicating various rearrangements, suggesting a greater evolutionary distance. With these
results, 6 isolates were selected for whole genome sequencing by
Illumina MiSeq platform.
Through successive analyzes
–
which included de novo assembly contigs, map to reference
assemblies and pairwise alignments
-
we came up to a 239648pb region containing the
In163
and ISCR14 inserted into a genomic island incorporated
into bacterial chromosome. The
bla
SPM
-
1
gene was inserted into ISCR4, found in a 13950pb region, which included genes
related to plasmids and transposons, however we do not know whether this element
s
chromosomal or plasmidial
. Through analysis of chromoso
mal genes mutations associated
with multidrug resistance, we found mutations in
oprD, ampD, mexZ, mexS, mexT, gyrA
e
parC
genes, which were common to the 6 ST277 isolates sequenced. This would explain the
MDR phenotype in
bla
SPM
-
1
and/or
rmtD
negative isol
ates. Furthermore, since these
microorganisms were isolated in different years and states, we believe these mutations are
ST277 characteristic, which may be one of the factors associated with the epidemic
characteristics of this clone
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/12860 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Silveira, Melise Chaves |
| Contributors | Galvão, Teca Calcagno, Albano, Rodolpho Mattos, Leão, Robson de Souza, Dávila, Alberto Martín Rivera, Marques, Elizabeth de Andrade, Assef, Ana Paula D'Alincourt Carvalho |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0031 seconds