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Previous issue date: 2016-02-23 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / As manifestações mais severas da doença de Chagas são a cardiomiopatia e fibrose cardíaca, mas o tecido muscular esquelético também é afetado pela infecção pelo T. cruzi, resultando em necrose e miosite. O acúmulo de matriz extracelular (MEC) durante o processo de fibrose está envolvido com a patogenia da doença de Chagas, mas seus mecanismos de regulação durante a infecção ainda não estão elucidados. Assim, nos propomos a comparar a resposta de cardiomiócitos (CM), fibroblastos cardíacos (FC) e mioblastos esqueléticos (L6E9) infectados pelo T. cruzi frente ao estímulo de TGF-\03B2, importante citocina fibrogênica envolvida no desenvolvimento da cardiomiopatia chagásica, analisando também os mecanismos de sinalização envolvidos neste processo. FC foram purificados a partir de culturas de CM. Purificação adequada de FC foi obtida somente a partir da 5ª dissociação de culturas de CM, revelada pela baixa detecção de desmina, proteína específica de cardiomiócitos. Culturas de CM, FC e L6E9 normais e infectados pelo T. cruzi (cepa Y) foram tratadas por 1h ou 48h com TGF-\03B2 (1-10 ng/ml). A expressão de FN, SMAD 2 fosforilada (PS2), fosfo-p38 e fosfo-c-Jun foram avaliadas por Western blot (WB) após 1h e 48h de tratamento com TGF-\03B2 (1-10 ng/ml). Análises de WB revelaram que mioblastos L6E9 e FC apresentam aumento de FN já a partir de 1ng/ml de TGF-\03B2, em contraste com CM, em que só foi observado aumento de MEC com 15ng/mL. A infecção pelo T. cruzi induziu uma diminuição da expressão deste componente de MEC em L6E9. FC, por sua vez, apresentam modulação de FN de acordo com o grau de infecção da cultura, com culturas com baixo grau de infecção apresentando redução de FN e culturas altamente infectadas mostrando aumento desta proteína de MEC. A distribuição de fibronectina (FN) também foi analisada por imunofluorescência indireta
FC e L6E9 apresentaram um aumento na expressão de FN a partir de 1ng/ml de TGF-\03B2, confirmando o WB. Após infecção pelo T. cruzi, foi observada uma desorganização e redução na expressão de FN em CM, FC e L6E9 infectados, enquanto células não infectadas adjacentes apresentaram perfis de FN similares ao controle. A resposta diferencial entre os tipos celulares frente ao estímulo com TGF-\03B2 resulta de mecanismos distintos de sinalização intracelular, uma vez que FC e L6E9 apresentam maior disparo da via de SMADs que CM, enquanto a via de p38 (independente de SMADS) é menos estimulada em FC quando comparados com CM e L6E9. Também foi avaliado o perfil de expressão de proteínas das vias de sinalização clássica e alternativa do TGF-\03B2 em culturas de FC normais e infectados com T. cruzi e tratados com 10ng/ml da citocina. Culturas infectadas e tratadas com TGF-\03B2 (10ng/ml) apresentaram uma redução nos níveis de fosforilação de SMAD 2 quando comparados com células normais tratadas. Culturas de FC infectadas não apresentaram aumento de fosfo-p38MAPK, mas disparo na via foi observado após tratamento com 10ng/ml de TGF-\03B2 em FC infectados. Aumento na fosforilação de c-Jun após a infecção e após tratamento com 10ng/ml de TGF-\03B2 também foi detectado em FC. Em conjunto, nossos dados sugerem que a expressão de FN é modulada diferencialmente por TGF-\03B2 em mioblastos L6E9, FC e CM, e que as vias moduladas por SMADS, p38 MAPK e c-Jun possam estar participando no processo de regulação de fibrose mediado pela citocina TGF-\03B2 após infecção pelo T. cruzi / The most severe manifestations of Chagas disease are cardiomyopathy and cardiac
fibrosis,
but the skeletal muscle tissue is also affected by
T. cruzi
infection, resulting in
necrosis and myositis. The accumulation of extracellular matrix (ECM) during the fibrosis
process is involved in the pathogenesis of Chagas disease, but the mechanisms of
its
regulation during infection are not clear yet. Therefore, we propose to compare the response
of cardiomyocytes (CM), cardiac fibroblasts (CF) and skeletal myoblasts (L6E9) infected with
T. cruzi
after TGF
-
β
stimulation, which is an important fibrogenic
cytokine involved in the
development of Chagas cardiomyopathy, also analyzing the signaling mechanisms involved
in this process. CF were purified from CM cultures
. Adequate
purification
was obtained after
the 5th dissociation
of CM cultures
,
as revealed b
y
low detection of desmin, a
cardiomyocyte
-
specific protein. Cultures of normal and
T. cruzi
(Y strain) infected CM, CF
and L6E9 were treated for
1h or
48 hs with TGF
-
β
(1
-
10 ng/ml)
. The expression of FN
,
phosphorylated
SMAD
2 (PS2), phospho
-
p38, and phospho
-
c
-
Jun were also evaluated by
Western blot (WB) after 1h and 48h treatment with TGF
-
β
(1
-
10 ng / ml). WB analysis
revealed that CF and L6E9 showed an increase in FN
expression from 1ng/ml of TGF
-
β
,
contrasting to CM, in which an increased in ECM was only o
bserved after 15ng/ml treatment
.
T. cruzi
infection induced a decrease in the expression of this
ECM
component in L6E9.
CF
presented FN modulation according to the d
egree of infection of the culture, with cultures
containing
a low degree of infection presenting a reduction of FN and highly infected cultures
showing an increase of this ECM protein.
T
he distribution of fibronectin (FN) was
also
analyzed by indirect immu
nofluorescence.
CF and L6E9 displayed a raise in FN expression
rfom 1 ng/mL, confirming WB.
After
T. cruzi
infection, disorganization and reduced FN
expression was observed in infected CM
, CF
and L6E9, while adjacent uninfected cells
showed similar FN prof
iles as controls. The differential response between cellular types
facing TGF
-
β
stimulation results from distinct intracellular signaling mechanisms, since CF
and L6E9 have higher
activation
of
SMAD
s pathway than CM, while p38 pathway
(independent of
SMAD
S
) is less stimulated in CF when compared to CM and L6E9. We also
evaluated the protein expression profile of classical and alternative TGF
-
β
signaling
pathways in normal and
T. cruzi
infected CF cultures, treated with 10 ng/ml of the cytokine.
Infected CF
cultures treated with TGF
-
β
(10ng/ml) showed a reduction in the levels of
phosphorylation of
SMAD
2 when compared with normal and treated controls. CF infected
cultures
did not
show increased phosphorylation of p38MAPK,
but activation in the pathway
was ob
served
after treatment with 10 ng/ml TGF
-
β
.
An increase in phosphorylation of c
-
Jun
after infection and after treatment with 10 ng/ml TGF
-
β
was also detected in CF.
When
considered together, o
ur data suggest that
FN expression is differentially modulated b
y TGF
-
β
in L6E9 mioblasts, CF and CM, and
pathways
modulated by
SMAD
S,
p38 MAPK
and c
-
Jun
may be participating in fibrosis regulatory process mediated by with TGF
-
β
cytokine after
T. cruzi
infection
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/12914 |
| Date | January 2015 |
| Creators | Silva, Tatiana Araújo |
| Contributors | Waghabi, Mariana Caldas, Lamas, Marcelo Einicker, Villa Verde, Déa Maria, Corte Real, Suzana, Mendes, Fábio de Almeida, Calvet, Claudia Magalhães |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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