Made available in DSpace on 2016-03-10T13:16:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2
jose_correa_ioc_dout_2007.pdf: 7604915 bytes, checksum: 254c899732de570995b8f8b6f7061ca5 (MD5)
license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5)
Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Endocitose em células eucarióticas é o processo de internalização de macromoléculas por diferentes vias, com diversas proteínas associadas, através do brotamento de vesículas na membrana plasmática e endereçamento destas vesículas a compartimentos endosomais no citoplasma. Os tripanosomatídeos são protozoários flagelados patogênicos de grande importância médica e veterinária que apresentam diferentes formas adaptativas ao longo de seu ciclo de vida. Estes parasitas estão estruturalmente organizados dentro de um arcabouço de microtúbulos subpeliculares, o que dificulta invaginações de membrana na maior parte do corpo celular. Entretanto, este arcabouço é descontinuado na região da bolsa flagelar, de onde o flagelo emerge do corpo. Formas epimastigotas do Trypanosoma cruzi apresentam além da bolsa flagelar uma segunda invaginação de membrana, o citóstoma/citofaringe, uma estrutura sustentada por microtúbulos especializados que participa ativamente no processo de endocitose. Esta tese teve por objetivo investigar as vias endocíticas presentes nos dois sítios competentes para a captação de nutrientes (bolsa flagelar e citóstoma) de epimastigotas de T. cruzi. Após incubação dos parasitas a 4oC ou 28oC com albumina, transferrina e LDL conjugadas a ouro coloidal e posterior processamento para microscopia eletrônica de transmissão (MET), foram observadas vesículas endocíticas revestidas brotando da bolsa flagelar. Análise do conteúdo protéico dos protozoários detectou a expressão de clatrina, confirmada por citometria de fluxo e análise in silico da base de dados genômicos do T. cruzi. Por microscopia confocal localizou-se a expressão de clatrina na bolsa flagelar dos parasitas...
(...) Como transferrina foi visualizada em vesículas sem revestimento localizadas majoritariamente no citóstoma, frações de membrana detergente-resistentes foram purificadas por fracionamento celular e o conteúdo lipídico foi analizado por cromatografia, sendo também obtidas as concentrações de proteína e colesterol destas frações de membrana. \201CDot blots\201D das frações foram positivos para marcadores universais de jangadas de lipídios (flotilina-1 e toxina B do cólera). Por imunofluorescência co-localizou-se marcação de transferrina e de anticorpos anti-flotilina no citóstoma. Assim, propomos que a endocitose de transferrina ocorre principalmente pelo citóstoma através de um domínio de membrana detergente-resistente. Epimastigotas foram também pré-tratadas para impedir especificamente endocitose mediada por clatrina e a endocitose por cavéolas, usando-se drogas que interferem com o citoesqueleto celular, seguindo-se incubação com transferrina. Dados de MET e citometria de fluxo mostraram que a endocitose de transferrina ocorreu normalmente nas amostras onde o brotamento de vesículas revestidas com clatrina foi impedido, não sendo porém observada nas amostras onde a endocitose por cavéolas foi inibida. Análise da curva de crescimento de parasitas tratados demonstrou uma relação positiva entre interferência nos domínios de membrana detergente-resistentes e sobrevivência das células. Este conjunto de dados permitiu elaborar um modelo dos mecanismos de endocitose em epimastigotas de T. cruzi. / Endocytosis in eukaryotic cells is the
in
corporation
process
o
f
macromolecules, t
hrough different pathways with different associated proteins,
through
vesicles budding at the plasma membrane and addressing of these vesicles
to cytoplasmic endosomal compartments. Trypanosomatids are pathogenic flagellate
protozoa of great medical and ve
terinary importance that present different evolutive
forms along their life cycle. These parasites are structurally organized inside a cage
of subpelicular microtubules, what makes it difficult to form membrane invagination
along most part of the cell body
. However, this cage is missing at the flagellar pocket
region, where the flagellum emerges from the cell. Epimastigote forms of
Trypanosoma cruzi
present besides the flagellar pocket a second membrane
invagination, the cytostome/cytopharynx
. This
structur
e
is
sustained by specialized
microtubules that actively participate
in the endocytic process. This thesis has
investigated the endocytic pathways at the two competent sites for nutrient uptake
(flagellar pocket and cytostome) of
T. cruzi
epimastigotes. Af
ter
parasites
incubation
at 28
o
C with gold
-
conjugated albumin
e
, transferrin or LDL, followed by processing for
transmission electron microscopy (TEM), it was possible to observe coated endocytic
vesicles
loaded with albumin,
budding off from the flagellar
pocket. Analysis of the
proteic content of epimastigote forms detected the expression of clathrin, confirmed
by flow cytometry and in silico analysis of the
T. cruzi
genomic database. Confocal
microscopy allowed the visualization of the clathrin expression
at the flagellar pocket.
As transferrin was seen in uncoated vesicles located mainly in the cytostome,
detergent
-
resistant membrane fractions were purified by cell fractioning and the
lipidic contents was analyzed by chromatography, as well as the protein
and
cholesterol contents in the fractions. Dot blots of such membrane fractions were
positive for lipid raft universal labels (flotillin
-
1 and cholera B toxin). By
immunofluorescence microscopy
,
transferrin and flotillin were co
-
localized at the
cytostome
. Thus we propose that endocytosis of transferrin occurs mainly through
the cytostome via detergent
-
resistant membrane domains.
Epimastigote forms were
pre
-
treated to specifically hinder clathrin
-
mediated and caveolae
-
mediated
endocytosis, by using drugs t
hat
impair these pathways and
interfere with the cell
cytoskeleton, followed by incubation with transferrin. Data from TEM and flow
cytometry showed that the endocytosis of transferrin occurred normally in
samples
where budding of clathrin
-
coated vesicles
was hindered, but it was not observed in
samples where caveolae
-
mediated endocytosis was inhibited. Analysis of growth
curves of treated parasites showed
a
relation between interference with detergent
-
resistant membrane domains and cell surviving. Our data
allowed to elaborate a
model depicting the endocytic mechanisms in
Trypanosoma cruzi
epimastigotes
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/13075 |
| Date | January 2007 |
| Creators | Corrêa, José Raimundo |
| Contributors | Pons, Andréa Henriques, Figueiredo, Regina Célia Bressan Queiróz de, Silva, Narcisa Leal Cunha e, Faria, Suzana Corte Real, Castro, Solange Lisboa de, Soares, Maurilio José |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0029 seconds