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Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A silicose é uma doença pulmonar, de caráter restritivo, causada pela inalação de
partículas de sílica cristalina. Se caracteriza pela indução de uma inflamação crônica
associada à intensa proliferação de fibroblastos e acúmulo exacerbado de
componentes de matriz extracelular, e para a qual não há um tratamento eficaz. Os
fibroblastos são considerados alvos cruciais em doenças de natureza fibrótica e o
desenvolvimento de sistemas que permitam avaliar a reatividade destas células é de
fundamental importância na busca por terapias anti-fibróticas. No presente estudo foi
desenvolvido um sistema de cultura primária em 3D (esferóides), utilizando
fibroblastos provenientes do pulmão de camundongos normais e silicóticos
objetivando analisar comparativamente os aspectos morfológicos/funcionais de
ambas as populações celulares. Os fibroblastos foram obtidos a partir da
dissociação mecânica/enzimática dos pulmões de camundongos Swiss-Webster 7
dias após a instilação intranasal de salina (controle) ou sílica (10 mg/animal). Após a
terceira passagem, as células foram cultivadas em placas de 96 poços, revestidas
com agarose, na ausência ou presença de IL-13 (40 ng/mL), sendo os esferóides
avaliados quanto a aspectos morfológicos (tamanho/diâmetro médio/constituição), e
funcionais tais como: proliferação, produção de citocinas (TGF-b e quimiocinas
(MCP-1)) e de colágeno. Através da análise por microscopia de luz invertida,
verificamos que os esferóides contendo fibroblastos de animais normais e silicóticos
mostraram progressiva diminuição do tamanho/diâmetro, e maior densidade, ao
longo do tempo analisado (1 – 4 dias), com os silicóticos apresentando valores
sempre superiores aos dos controles. A estimulação com IL-13 induziu claro
aumento de tamanho/diâmetro em ambas as populações de esferóides. A análise
por microscopia eletrônica de varredura (MEV) revelou haver diferenças
morfológicas importantes entre os grupos normal e silicótico, no que tange ao
formato e à constituição celular, com expressivo aumento no conteúdo de matriz
extracelular detectado na condição de estimulação com IL-13. De forma
interessante, foi observado que os esferóides silicóticos apresentaram níveis basais
aumentados de proliferação celular e secreção de TGF-b, assim como de colágeno,
em comparação aos dos controles. Tanto esferóides normais quanto silicóticos
foram sensíveis à estimulação com IL-13, sendo verificado aumento equivalente na
taxa de proliferação e nos níveis de TGF-b e MCP-1 em ambos os grupos. No que
tange a produção de colágeno, os esferóides normais mostraram-se responsivos à
IL-13 enquanto os silicóticos não. Em conjunto, nossos achados mostraram que os
fibroblastos pulmonares de camundongos adultos são: (i) passíveis de serem
cultivados em sistema de cultura 3D; (ii) responsivos à estimulação com IL-13 e que;
(iii) os esferóides silicóticos apresentam características de ativação em comparação
aos normais. Além disso, este modelo mostrou-se reprodutível e promissor quanto a
possibilidade de utilização futura na busca por compostos com atividade antifibrótica. / Silicosis is a restrictive pulmonary disease caused by inhalation of crystalline silica
particles, which is characterized by chronic inflammation associated with intense
fibroblast proliferation and exacerbated accumulation of extracellular matrix
components. There is no effective treatment for this disease. Fibroblasts are
considered crucial cells in fibrosis, and the development of systems which lead to
evaluate their reactivity is important in the search for anti-fibrotic therapy. In this study
we aimed to establish a system of primary cell culture in 3D (spheroids) using lung
fibroblasts from normal and silicosis mice, in order to perform a comparative analysis
of morphological/functional aspects of both cell populations. Fibroblasts were
obtained after mechanical/enzymatic dissociation of the lung tissue from Swiss-
Webster mice, 7 days after intranasal instillation of saline (control) or silica (10 mg /
animal). After the third passage, the cells were cultured in 96-well plates coated with
agarose, in the absence or presence of IL-13 (40 ng/ml) and the spheroids were
evaluated regarding the morphological (size/diameter/constitution) and functional
parameters (proliferation and generation of cytokine (TGF-b), chemokine (MCP-1)
and collagen. By means of inverted light microscopy, we noted that spheroids
containing fibroblasts from normal and silicotic animals showed a progressive
reduction in size/ diameter and increase in density when analyzed for 1 - 4 days of
culture. Those from silicotic mice showed themselves bigger as compared to
controls. Stimulation with IL-13 induced an increase in size/diameter of both cell
populations. The analysis by scanning electron microscopy (SEM) revealed
significant morphological differences between normal and silicotic groups, with a
significant increase in the content of extracellular matrix being detected under
condition of stimulation with IL-13. Interestingly, we observed that spheroids with
cells from silicotic mice showed increased basal levels of cell proliferation and
secretion of TGF-b and collagen as compared to the controls. Both spheroid
populations were sensitive to IL-13 stimulation as attested by increased cell
proliferation as well as TGF-b and MCP-1 levels. Increased collagen production was
detected only in the case of normal cells. Altogether, our findings show that adult
mouse lung fibroblasts grow in a 3D culture system, that they are responsive to IL-13
stimulation and that those from silicotic mice showed an activated phenotype as
compared to the controls. Thus, this experimental model seems to be reproducible
and promising in the case of searching for anti-fibrotic compounds.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/7033 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Silva, Andressa Moraes Guimarães da |
| Contributors | Barbosa, Helene Santos, Rossi, Maria Isabel Doria, Alves, Luiz Anastácio, Daleprane, Julio Beltrame, Barreto, Rubem Figueiredo Sadok Menna-, Silva, Patrícia Machado Rodrigues e |
| Publisher | Instituto Oswaldo Cruz |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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