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Previous issue date: 2014-05-07 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, Brasil / O gênero Mycobacterium possui mais de 160 espécies, dentre elas importantes patógenos como M. leprae, M. tuberculosis e M. bovis. Embora muito se conheça sobre estes patógenos, poucos estudos se concentraram na caracterização detalhada de micobactérias não-tuberculosas (MNT), que apresentam distribuição ambiental variada e são oligotróficas. Embora muitas sejam consideradas saprófitas, acredita-se que a infecção sub-clínica de animais e humanos esteja subestimada. A infecção por MNT ambientais é considerada como um dos fatores que modulam a resposta protetora conferida pela vacina BCG. Neste contexto, o presente estudo tem como foco a caracterização das MNT de crescimento rápido provenientes da Coleção de Bactérias da Mata Atlântica (CBMA) do IOC/FIOCRUZ, com dois objetivos principais: (1) caracterizar espécies que possam ser utilizadas no desenvolvimento de um novo sistema de expressão de proteínas heterólogas e (2) identificar antígenos e vias metabólicas compartilhadas entre espécies patogênicas e saprófitas. Os isolados obtidos da CBMA/IOC foram cultivados em meios LB contendo Tween 80, sob agitação a 25 °C. Foram geradas curvas de crescimento a partir da leitura da DO a 600 nm de triplicatas biológicas, e determinadas características morfológicas. Diversos testes bioquímicos foram realizados para uma melhor caracterização desses isolados
O perfil de secreção de proteínas ao longo do crescimento foi verificado por SDS-PAGE, a presença de proteases secretadas avaliada por zimografia e a presença e atividade de celulases foi verificada através de western blot, zimografia e ensaio enzimático. A capacidade de transformação por DNA plasmidial foi avaliada por eletroporação. Também foram propostos agrupamentos filogenéticos com base na análise de sequências de regiões dos genes 16S rRNA (rrs) e hsp65. Em paralelo, foi verificada por western blot a presença de antígenos micobacterianos comuns, já descritos como tendo papel importante na geração de resposta imune (Mpt64, Mpt70, Mpt83 e antígenos do complexo 85) ou no metabolismo e sobrevivência do M. tuberculosis (GlnA1 e HspX). O perfil de crescimento e as características morfológicas e bioquímicas dos isolados parecem confirmar o agrupamento filogenético proposto. Atividade celulásica foi observada em apenas dois isolados, apesar de todos expressarem esta proteína, e não foi encontrada atividade proteásica no filtrado de cultura nas condições testadas
Todos os isolados são transformáveis, mas apresentam diferenças quanto à eficiência e integridade do vetor. As análises por western blot revelaram a presença de proteínas do complexo 85, Mpt70 e GlnA1 e ausência de reatividade para os antígenos Mpt64, Mpt83 e HspX. Desse modo, três isolados foram selecionados para prosseguir com o desenvolvimento do novo sistema de expressão de proteínas heterólogas secretadas. A presença de alguns antígenos compartilhados fornecem novos subsídios para elucidar a relação entre MNT e vacina BCG / The genus Mycobacterium has more than 160 species, among them important pathogens such as M. leprae, M. tuberculosis and M. bovis. Although much is known about these pathogens, few studies have focused on the detailed characterization of non-tuberculous mycobacteria (NTM), which present wide environmental distribution and are oligotrophic. While many are considered saprophytes, it is believed that the subclinical infection of humans and animals is underestimated. The environmental NTM infection is considered as one of the factors that modulate the protective response provided by BCG vaccine. In this context, the present study focuses on the characterization of rapidly growing MNT from the Atlantic Forest Bacterial Collection (CBMA - Coleção de Bactérias da Mata Atlântica, IOC / FIOCRUZ), with two main objectives: (1) characterize species which may be used to develop a new system for heterologous protein expression and (2) to identify antigens and metabolic pathways shared between pathogenic species and saprophytes. The isolates obtained from CBMA/IOC were grown in LB media containing Tween 80, under agitation, at 25 °C. Growth curves were generated from the reading of the OD at 600 nm of biological triplicates, and certain morphological characteristics were determined. Several biochemical tests were performed to better characterize these isolates. The profile of secreted proteins was verified by SDS-PAGE along the growth curves, the presence of secreted proteases evaluated by zymography and the presence and activity of cellulases was verified by western blot, enzymatic assay and zymography. The transformation capacity of the individual isolates was evaluated by electroporation of plasmid DNA. Phylogenetic groupings were also proposed based on sequencing of regions from the 16S rRNA (rrs) and hsp65 genes. In parallel, the presence of shared mycobacterial antigens described as playing important roles in generating immune responses (Mpt64, Mpt70, Mpt83 and antigen 85 complex) or in metabolism and survival of M. tuberculosis, was verified by western blot. The growth profile and the morphological and biochemical characteristics of the isolates appear to confirm the phylogenetic grouping proposed. Cellulase activity was observed in only two strains, although all express this protein; protease activity was not found in the culture filtrate under the conditions tested. All isolates are transformable, but differ as to the efficiency and integrity of the vector. Western blot analysis revealed the presence of Ag85 complex, Mpt70 and GlnA1 and absence of reactivity for the Mpt64 and Mpt83 antigens as well as HspX. Thus, three isolates were selected to proceed with the development of a new heterologous protein expression system. The presence of some shared antigens provide new information to elucidate the relationship between NTM and BCG vaccine.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/7699 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Emmerick, Leandro Santiago |
| Contributors | Escobar, Patricia Cuervo, Niero, Cristina Viana, Medeiros, Marco Alberto, Teixeira, Raquel Lima Figueiredo, Brandão, Adeílton Alves, Lima, Leila de Mendonça |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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