Made available in DSpace on 2014-05-29T12:18:46Z (GMT). No. of bitstreams: 4 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 69441.pdf: 2989051 bytes, checksum: 8e1f78fb34fb10ed6a62ddab3e860e85 (MD5) 69441.pdf.txt: 252167 bytes, checksum: fa3f048c557c5ecc17e4f0b7176dacb5 (MD5) 69441.pdf.jpg: 1240 bytes, checksum: f1b121f954ab809e4e361e03e07c42ac (MD5) Previous issue date: 2014-05-07 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, Brasil / O gênero Mycobacterium possui mais de 160 espécies, dentre elas importantes patógenos como M. leprae, M. tuberculosis e M. bovis. Embora muito se conheça sobre estes patógenos, poucos estudos se concentraram na caracterização detalhada de micobactérias não-tuberculosas (MNT), que apresentam distribuição ambiental variada e são oligotróficas. Embora muitas sejam consideradas saprófitas, acredita-se que a infecção sub-clínica de animais e humanos esteja subestimada. A infecção por MNT ambientais é considerada como um dos fatores que modulam a resposta protetora conferida pela vacina BCG. Neste contexto, o presente estudo tem como foco a caracterização das MNT de crescimento rápido provenientes da Coleção de Bactérias da Mata Atlântica (CBMA) do IOC/FIOCRUZ, com dois objetivos principais: (1) caracterizar espécies que possam ser utilizadas no desenvolvimento de um novo sistema de expressão de proteínas heterólogas e (2) identificar antígenos e vias metabólicas compartilhadas entre espécies patogênicas e saprófitas. Os isolados obtidos da CBMA/IOC foram cultivados em meios LB contendo Tween 80, sob agitação a 25 °C. Foram geradas curvas de crescimento a partir da leitura da DO a 600 nm de triplicatas biológicas, e determinadas características morfológicas. Diversos testes bioquímicos foram realizados para uma melhor caracterização desses isolados O perfil de secreção de proteínas ao longo do crescimento foi verificado por SDS-PAGE, a presença de proteases secretadas avaliada por zimografia e a presença e atividade de celulases foi verificada através de western blot, zimografia e ensaio enzimático. A capacidade de transformação por DNA plasmidial foi avaliada por eletroporação. Também foram propostos agrupamentos filogenéticos com base na análise de sequências de regiões dos genes 16S rRNA (rrs) e hsp65. Em paralelo, foi verificada por western blot a presença de antígenos micobacterianos comuns, já descritos como tendo papel importante na geração de resposta imune (Mpt64, Mpt70, Mpt83 e antígenos do complexo 85) ou no metabolismo e sobrevivência do M. tuberculosis (GlnA1 e HspX). O perfil de crescimento e as características morfológicas e bioquímicas dos isolados parecem confirmar o agrupamento filogenético proposto. Atividade celulásica foi observada em apenas dois isolados, apesar de todos expressarem esta proteína, e não foi encontrada atividade proteásica no filtrado de cultura nas condições testadas Todos os isolados são transformáveis, mas apresentam diferenças quanto à eficiência e integridade do vetor. As análises por western blot revelaram a presença de proteínas do complexo 85, Mpt70 e GlnA1 e ausência de reatividade para os antígenos Mpt64, Mpt83 e HspX. Desse modo, três isolados foram selecionados para prosseguir com o desenvolvimento do novo sistema de expressão de proteínas heterólogas secretadas. A presença de alguns antígenos compartilhados fornecem novos subsídios para elucidar a relação entre MNT e vacina BCG / The genus Mycobacterium has more than 160 species, among them important pathogens such as M. leprae, M. tuberculosis and M. bovis. Although much is known about these pathogens, few studies have focused on the detailed characterization of non-tuberculous mycobacteria (NTM), which present wide environmental distribution and are oligotrophic. While many are considered saprophytes, it is believed that the subclinical infection of humans and animals is underestimated. The environmental NTM infection is considered as one of the factors that modulate the protective response provided by BCG vaccine. In this context, the present study focuses on the characterization of rapidly growing MNT from the Atlantic Forest Bacterial Collection (CBMA - Coleção de Bactérias da Mata Atlântica, IOC / FIOCRUZ), with two main objectives: (1) characterize species which may be used to develop a new system for heterologous protein expression and (2) to identify antigens and metabolic pathways shared between pathogenic species and saprophytes. The isolates obtained from CBMA/IOC were grown in LB media containing Tween 80, under agitation, at 25 °C. Growth curves were generated from the reading of the OD at 600 nm of biological triplicates, and certain morphological characteristics were determined. Several biochemical tests were performed to better characterize these isolates. The profile of secreted proteins was verified by SDS-PAGE along the growth curves, the presence of secreted proteases evaluated by zymography and the presence and activity of cellulases was verified by western blot, enzymatic assay and zymography. The transformation capacity of the individual isolates was evaluated by electroporation of plasmid DNA. Phylogenetic groupings were also proposed based on sequencing of regions from the 16S rRNA (rrs) and hsp65 genes. In parallel, the presence of shared mycobacterial antigens described as playing important roles in generating immune responses (Mpt64, Mpt70, Mpt83 and antigen 85 complex) or in metabolism and survival of M. tuberculosis, was verified by western blot. The growth profile and the morphological and biochemical characteristics of the isolates appear to confirm the phylogenetic grouping proposed. Cellulase activity was observed in only two strains, although all express this protein; protease activity was not found in the culture filtrate under the conditions tested. All isolates are transformable, but differ as to the efficiency and integrity of the vector. Western blot analysis revealed the presence of Ag85 complex, Mpt70 and GlnA1 and absence of reactivity for the Mpt64 and Mpt83 antigens as well as HspX. Thus, three isolates were selected to proceed with the development of a new heterologous protein expression system. The presence of some shared antigens provide new information to elucidate the relationship between NTM and BCG vaccine.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-10-27 / Micobactérias não tuberculosas (MNT) são bactérias ubiquitárias e equipadas para suportar diferentes temperaturas e falta de nutrientes. Elas também possuem resistência a muitos desinfetantes e antimicrobianos. Várias espécies do gênero Mycobacterium já foram associadas a biofilmes em instrumentais cirúrgicos e sistemas de água em ambientes hospitalares e isso tem importantes implicações em epidemiologia, sobrevida no meio ambiente e resistência a biocidas e antimicrobianos. Micobactérias de crescimento rápido (MCR) têm causado surtos de infecções em procedimentos invasivos, como cirurgias plásticas e oftalmológicas, cirurgias por via laparoscópica e procedimentos de estética. Este estudo teve como objetivo investigar a capacidade de cepas de MCR com fenótipos diferentes (liso e rugoso), especialmente da espécie Mycobacterium massiliense, de formar biofilmes, comparando cepas relacionadas a surtos e cepas não relacionadas a qualquer surto. Vinte e sete isolados foram analisados quanto à adesão das bactérias a diferentes suportes abióticos na presença de diferentes soluções. Foram obtidas curvas de crescimento das bactérias aderidas a placas de poliestireno usando resazurina como indicador. Foram também analisadas a produção de glicopeptideolipídeo e polissacarídeos na parede bacteriana e a capacidade de deslizamento das bactérias em meio semissólido. As bactérias aderidas foram visualizadas em microscópio óptico e por microscopia eletrônica. Os resultados obtidos com micobactérias relacionadas ou não a surtos foram similares. A presença de glutaraldeído 2% inibiu a aderência ao plástico de cepas com fenótipo rugoso. Com esses resultados, concluímos que a formação de biofilmes não diferencia, isoladamente, cepas de surto de cepas não relacionadas a surtos, sejam elas de fenótipo liso ou rugoso. É mais provável que um conjunto de fatores possa facilitar a seleção de determinadas cepas mais adaptadas para causar infecções e com potencial para gerar surtos. A identificação e a caracterização destes fatores poderão contribuir para o controle de novos surtos e a vigilância epidemiológica de infecções causadas por estes patógenos oportunistas. / Non-Tuberculous Mycobacteria (NTM) are ubiquitously distributed bacteria equipped to support different temperatures and lack of nutrients. They also show resistance to diverse disinfectants and antimicrobials. Several Mycobacterium species have been associated to biofilms in surgical equipment and water systems in hospital environment and this has important implications in epidemiology, survival in the environment and resistance to biocides and antimicrobials. Rapidly-Growing Mycobacteria (RGM) have been associated to outbreaks of infections in invasive procedures, as plastic and ophthalmological surgeries, laparoscopic surgeries and cosmetic procedures. The objective of this study was to investigate the capacity of RGM with different phenotypes (smooth and rough), especially Mycobacterium massiliense, of forming biofilms, by comparison of isolates related to outbreaks with isolates not related to outbreaks. Twenty-seven isolates were analyzed with respect to adhesion to different abiotic supports in the presence of different solutions. Growth curves were obtained using resazurin as indicator. The production of glycopeptidolipids and polysaccharides in the cell wall and the sliding motility in semisolid medium were also analyzed. Bacteria adhered to solid supports were visualized through optical and electronic microscopes. Results obtained with outbreak-related isolates and isolates not related to outbreaks were similar. The presence of 2% glutaraldehyde inhibited the adhesion of rough colony phenotype bacteria to plastic. With these results we concluded that biofilm formation capacity cannot differentiate outbreak-related isolates from isolates not related to outbreaks, or rough from smooth phenotype bacteria. It is possible that a collection of factors may facilitate the selection of particular strains more adapted to cause infections and with potential to originate outbreaks. The identification and characterization of these factors could contribute to the control of new outbreaks and to the epidemiological surveillance of infections by these opportunistic pathogens. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2016-07-01T12:30:00Z (GMT). No. of bitstreams: 2 mariana_santos_ioc_mest_2015.pdf: 2485159 bytes, checksum: 4635cdb126d5d6a4d6de189df627fe73 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Made available in DSpace on 2016-07-05T23:52:43Z (GMT). No. of bitstreams: 3 mariana_santos_ioc_mest_2015.pdf.txt: 155225 bytes, checksum: a4a9286f9502f99361f8f66b55758259 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) mariana_santos_ioc_mest_2015.pdf: 2485159 bytes, checksum: 4635cdb126d5d6a4d6de189df627fe73 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Teresina, PI, Brasil / Nas infecções causadas pelo gênero Mycobacterium identificar a espécie é importante para distinguir entre as cepas e agrupá-las por critérios de interesse para microbiologistas e clínicos, influenciando inclusive no esquema de tratamento a ser aplicado. Segundo a World Health Organization, em 2014 a tuberculose atingiu o mesmo patamar que a infecção por HIV (Human Immunodeficiency Virus) em relação à mortalidade. Por outro lado, as micobacterioses por micobactérias não tuberculosas (MNT) vêm aumentando, mas como não é de notificação compulsória, pouco se sabe da diversidade de espécies que acometem os pacientes no estado do Piauí. Assim, o presente estudo teve como objetivo, estimar a frequência de infecção por Complexo Mycobacterium tuberculosis e MNT, correlacionar os métodos microbiológios e moleculares utilizados na sua identificação e descrever o perfil de sensibilidade a tuberculostáticos nas amostras de M. tuberculosis, isoladas de pacientes referenciados ao Laboratório Central de Saúde Pública do Piauí (LACEN-PI) no período de janeiro 2014 a março de 2015. Para tal, foi realizado estudo descritivo transversal em 142 espécimes clínicos de pacientes, correspondendo a 20,1% dos casos suspeitos enviados ao LACEN-PI. Na maioria dos casos a espécie M. tuberculosis foi identificada (69,7%; 99/142) e em 9,9% (14/142) foram isoladas MNT. O restante dos casos (20,4%; 29/142) não foi possível fazer o diagnóstico definitivo. As espécies de micobactérias não tuberculosas identificadas foram M. abscessus (3,5%); M. avium (1,4%), M. intracelullare (1,4%), M. asiaticum (0,7%), M.szulgai (0,7%) e M. kansasii (0,7%), e maioria dos casos era do sexo masculino (63,4%; 9/14) e apenas 1/64 (1,6%) era HIV positivo Comparando os métodos laboratoriais utilizados na identificação de M. tuberculosis foi evidenciado 100% de concordância entre a plataforma automatizada geneXpert (Xpert MTB/ RIF) e o cultivo microbiológico in vitro, em 56 espécimes de pacientes com pneumopatia pulmonar. A frequência de amostras resistentes às drogas testadas foi de 7,8% (5/64), das quais, três eram multidroga resistente e uma extensivamente resistente. Conclui-se que, as infecções por M. tuberculosis foram mais frequentes que as causadas por micobactérias não tuberculosas e a resistência às drogas apresentou-se mais elevada que a taxa mundial (3,3%). As espécies MNT identificadas são potencialmente patogênicas e é importante notar que por questões metodológicas não foi possível confirmar os 20,4% dos suspeitos, portanto, maior atenção deve ser dada na correta coleta dos espécimes clínicos. A utilização da metodologia Xpert na rotina laboratorial, comparada a metodologias microbiológicas, demonstrou alta sensiblidade e especificidade na detecção de resistência à rifampicina e rapidez na produção do resultado / Abstract: In infections caused by Mycobacterium genus identify the species is important to distinguish between strains and group them by criteria of interest to microbiologists and clinicians, including influencing the treatment regimen to be applied. According to the World Health Organization, in 2014 TB reaches an equal footing that of the HIV (Human Immunodeficiency Virus) infection on mortality. On the other hand, mycobacteriosis by nontuberculous mycobacteria (NTM) has increased, however as it is not of mandatory notification and little is known about the diversity of species that affect patients in the state of Piaui. The present study aimed to estimate the frequency of Mycobacterium tuberculosis and NTM infections, correlate the microbiological and molecular methods used to identify them and describe the sensibility profile of the TB drugs in M. tuberculosis samples isolated from patients referred to t the Piaui State Public Health Central Laboratory (LACEN-PI), from January 2014 to March 2015. To this end, a cross-sectional descriptive study was performed on 142 clinical specimens of patients, corresponding to 20.1% of suspected cases submitted to LACEN-PI. In most cases the species M. tuberculosis was identified (69.7%, 99/142) and 9.9% (14/142) were isolated NTM. In the remaining cases (20.4%; 29/142) it was not possible to make a conclusive diagnosis. The nontuberculous mycobacteria species identified were M. abscessus (3.5%); M. avium (1.4%), M. intracelullare (1.4%), M. asiaticum (0.7%), M. szulgai (0.7%) and M. kansasii (0.7%) in most of the cases the subjects were male (63.4%; 9/14) and only 1/64 (1.6%) were HIV positive. Comparing the laboratory methods used in the identification of M. tuberculosis 100% agreement was evidenced between the automated platform GeneXpert (Xpert MTB/RIF) and the microbiological culture in vitro, in 56 specimens of patients with pulmonary pneumonitis The frequency of strains resistant to the tested drugs was 7.8% (5/64), of which three were multidrug-resistant and one was extensively drug-resistant. In conclusion, the M. tuberculosis infections were more frequent than those caused by nontuberculous mycobacteria and drug resistance was found to be higher than the global rate (3.3%). The identified NTM species are potentially pathogenic and it is important to note that for methodological issues 20.4% of the suspects could not be confirmed, therefore, greater attention should be paid to the correct collection of clinical specimens. The use of the Xpert method in laboratory routine compared to microbiological methods showed high sensibility and specificity to the detection of rifampicin resistance and speed in the result production

Orientador: Helio Langoni / Resumo: EBERHARDT, B.G. Avaliação de micro-organismos zoonóticos em filés de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus). Botucatu, 2018. 71p. Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista. RESUMO Cinquenta filés de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) obtidos em mercado de peixes no município de Ourinhos, Estado de São Paulo, foram analisados quanto à prevalência para Aeromonas hydrophila, Edwardsiella tarda, Mycobacterium spp. e Cianobactérias. Amostras de músculo foram avaliadas por PCR para Aeromonas hydrophila, Edwardsiella tarda e Mycobacterium spp., enquanto que as amostras para cianobactérias foram analisadas por PCR em Tempo Real (qPCR). Os resultados obtidos demonstraram ausência de Aeromonas hydrophila e Edwardsiella tarda nas amostras de filés. A prevalência para Mycobacterium spp. foi de 100% (50/50). Realização posterior de sequenciamento revelou Mycobacterium gordonae. Esta bactéria é considerada um colonizador comum, normalmente não patogênico, porém, há relatos de literatura que demonstram risco de infecção em indivíduos imunossuprimidos e até mesmo imunocompetentes. A taxa de prevalência para cianobactérias foi de 48% (24/50). As cianobactérias (algas azuis) produzem grande quantidade de metabólitos bioativos ou mesmo tóxicos, incluindo toxinas associadas a problemas ambientais e de saúde pública. Considerando a natureza e o papel das cianobactérias como patógenos emergentes, a elevada prevalência... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

As micobactérias compreendem um grupo de organismos que são heterogêneos em termos de metabolismo, crescimento, nicho ambiental, epidemiologia, patogenicidade, distribuição geográfica e associação com doenças. O diagnóstico micobacteriológico é atualmente um desafio aos laboratórios. Com a descrição de novas espécies de micobactérias nos últimos anos, tem sido cada vez mais difícil identificar com precisão estas espécies. Uma questão básica na identificação em micobactérias é a diferenciação entre o Complexo Mycobacterium tuberculosis e as Micobactérias Não Causadoras de Tuberculose (MNT); no entanto tem sido cada vez mais importante a diferenciação das MNT. Em virtude das semelhanças fenotípicas e genotípicas, é necessário a aplicação e desenvolvimento de metodologias que melhor caracterizem as MNT para que seja possível determinar de forma mais precisa a prevalência das diferentes espécies. Além disso, diferentes espécies de MNT podem apresentar diferenças no perfil de sensibilidade às drogas terapêuticas, sendo que a identificação precisa é crucial para a adoção de terapia medicamentosa adequada. O objetivo deste trabalho foi caracterizar os isolados de MNT através da comparação entre duas técnicas moleculares, a técnica de PRA-hsp65 e um kit comercial GenoType® Mycobacterium CM, usando o método de sequenciamento do gene hsp65 como padrãoouro. Foram analisadas 96 isolados e a concordância entre os resultados do PRA-hsp65 e do GenoType® Mycobacterium CM foi de 92%. O método molecular PRA-hsp65 mostrou-se eficaz na identificação das espécies em 91% das amostras e o GenoType® Mycobacterium CM em 92%. Em relação aos custos referentes aos dois métodos, foi possível estabelecer que o PRA-hsp65 apresentou um valor final consideravelmente inferior ao do GenoType® Mycobacterium CM. No entanto, a técnica comercial necessita um prazo mais curto (2 dias) para ser realizada em comparação com a técnica PRA-hsp65 (requer 5 dias). Na nossa avaliação, a aplicabilidade do PRA-hsp65 aumenta a qualidade e rapidez do resultado final, já que se mostrou discriminatório, de baixo custo e relativamente de fácil execução na identificação de micobactérias. É possível concluir que ambas as técnicas moleculares avaliadas neste estudo apresentaram uma ótima capacidade de identificação de MNT, sendo que a implementação destas técnicas dependerá das características dos diferentes laboratórios bem como as necessidades clínicas das diferentes instituições. / Mycobacteria comprise a group of organisms that are heterogeneous in terms of metabolism, growth, environmental niche, epidemiology, pathogenicity, geographic distribution and disease association. The laboratory diagnosis of mycobacteria is currently a challenge to laboratories. Due to the increased description of new species of mycobacteria in recent years it is becoming difficult to accurately identify these species. A basic question in the identification of mycobacteria is the differentiation between Mycobacterium tuberculosis and the Non-Tuberculous Mycobacteria (NTM); however it has been increasingly important to differentiate the NTM species. Due to the fact that there are phenotypic and genotypic similarities, it is necessary to apply and develop methodologies to better characterize the NTM to be able to determine more accurately the prevalence of different species. Furthermore, different NTM species may differ in the profile of sensitivity to therapeutic drugs, and accurate identification is crucial for the adoption of appropriate drug therapy. The objective of this study was to characterize NTM isolates by comparing two molecular techniques, the technique of PRA-hsp65 (PCR-Restriction Enzyme Analysis) and a commercial kit GenoType® Mycobacterium CM, using the sequencing the hsp65 gene as gold standard. We analyzed 96 samples and the concordance between the results of the PRA-hsp65 and the GenoType® Mycobacterium CM was 92%. The PRA-hsp65 molecular method proved to be effective in 91% of species identification and the GenoType® Mycobacterium CM in 92%. Regarding costs for the two methods, we could establish that the PRA-hsp65 had a final value considerably lower than the GenoType® Mycobacterium CM. However, the commercial technique requires a shorter period (2 days) to be performed in comparison with the technique PRA-hsp65 (requires five days). In our evaluation, the applicability of the PRA-hsp65 increases the quality and speed of the final result (in relation to traditional phenotypic identification or outsourcing in referral centers), and proved to be discriminatory, inexpensive and relatively easy to perform the identification of mycobacteria. Finally, we conclude that both molecular techniques evaluated in this study showed a great capacity for identification of NTM and that the implementation of these techniques. However, depend on the characteristics of different laboratories as well as the clinical needs of different institutions.

Submitted by Regina Adriana de Oliveira Calsolari null (reginaocalsolari@hotmail.com) on 2016-03-29T12:32:41Z No. of bitstreams: 1 tesefinal290320162.pdf: 1741802 bytes, checksum: 7ee9a12184c5ee4dff772984cbbe4e58 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-03-29T20:34:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 calsolari_rao_dr_bot.pdf: 1741802 bytes, checksum: 7ee9a12184c5ee4dff772984cbbe4e58 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-29T20:34:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 calsolari_rao_dr_bot.pdf: 1741802 bytes, checksum: 7ee9a12184c5ee4dff772984cbbe4e58 (MD5) Previous issue date: 2016-03-01 / Estima-se que um em cada quatro brasileiros esteja infectado pelo bacilo de Koch, e apenas em 2013, 80 mil casos de tuberculose foram notificados ao Ministério da Saúde, dos quais 6,5 mil foram a óbito. O exame laboratorial para o diagnóstico da tuberculose é feito pelos seguintes métodos tradicionais: Baciloscopia (BAAR) e Cultura, considerada o padrão ouro, porém com um tempo de realização demorado (em torno de oito semanas). A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é um método de amplificação de DNA que pode ser útil no diagnóstico diferencial da tuberculose com outras infecções pulmonares. Além disso, a PCR pode confirmar a identificação da micobactéria em materiais clínicos que apresentem uma difícil positividade. Objetivos – Avaliar a positividade de Mycobacterium spp. em diferentes materiais biológicos utilizando a técnica de PCR para os alvos Internal Transcribed Spacer (ITS) 16S-23S rDNA e gene hsp 65. Material e métodos – Cento e trinta materiais biológicos de pacientes com suspeita de tuberculose pulmonar ou extrapulmonar foram investigados para pesquisa de Mycobacterium spp. por ITS-PCR e pesquisa de fragmento do gene hsp65, no período de março de 2012 a abril de 2013. Para identificação das espécies de micobactérias foi utilizada a pesquisa do gene IS6110, e técnica Restriction Enzyme Pattern Analysis (PCR-PRA). Para algumas amostras positivas pela PCR foi realizado o sequenciamento para identificação da espécie. Foram avaliados dados demográficos e condições associadas. A comparação entre as técnicas foi verificada pelo teste χ2. Das amostras pesquisadas no escarro foram calculadas a sensibilidade e especificidade da PCR e da baciloscopia em relação à cultura. Foi considerado estatisticamente significante quando o valor do p foi < 0,05. Resultados - A positividade da técnica de PCR (31,6%) foi maior quando comparada ao BAAR (23,4%) e cultura (22,4%), (p=0,00). A sensibilidade e especificidade da baciloscopia em relação à cultura foram de 100% e 54%, respectivamente. Na comparação do PCR para as amostras de escarro a sensibilidade foi de 100% e especificidade de 81%. Ao avaliarmos os fatores de risco observamos uma associação positiva entre BAAR positivo, PCR positivo e cultura positiva com consumo de álcool e entre PCR positivo e tabagismo. Conclusão- O estudo demonstrou que a pesquisa de Mycobacterium spp. diretamente de materiais biológicos pela técnica de PCR pode ser uma perspectiva viável para diagnóstico, principalmente quando realizada em amostras extrapulmonares. / It is estimated that one in every four Brazilians is infected with Koch's bacillus, and just in 2013, eighty thousand cases of tuberculosis were reported to the Department of Health, of which 6.5 million died. The laboratory test for the diagnosis of tuberculosis is made by the following traditional methods: baciloscopy and culture, considered the gold standard, but with a long holding time (around 8 weeks). Polymerase chain reaction (PCR) is a DNA amplification method that can be useful in the differential diagnosis of pulmonary tuberculosis with other infections. In addition, PCR can confirm the identification of mycobacteria in clinical materials that exhibit a difficult positivity. Objectives - To evaluate the positivity of Mycobacterium spp. in different biological materials using the PCR technique for the Internal Transcribed Spacer (ITS) 16S-23S rDNA gene and hsp 65 targets. Materials and Methods - One hundred and thirty biological materials of patients with suspected pulmonary or extrapulmonary tuberculosis were investigated for Mycobacterium tuberculosis spp. by ITS-PCR research and gene fragment hsp65 research, from March 2012 to April 2013. To identify the species of mycobacteria was used the IS6110 gene research and PCR-PRA technique). For some positive samples was performed by PCR sequencing to species identification. They evaluated demographics and associated conditions. The comparison between the techniques was checked by χ² test. The samples surveyed in sputum were calculated sensitivity and specificity of PCR and baciloscopy in relation to culture. It was considered statistically significant when the p value was <0.05. Results - The PCR positivity (31.6%) was greater when compared to baciloscopy (23.4%) and culture (22.4%) (p = 0.00). The sensitivity and specificity of baciloscopy in relation to culture for sputum samples was 100% and 54%, respectively. When comparing the PCR for sputum samples, sensitivity was 100% and specificity of 81%. To evaluate the risk factors it was observed a positive association between baciloscopy positive, and culture positive with alcohol consumption and between PCR positive and smoking. Conclusion - The study demonstrated that the research for Mycobacterium spp. PCR directly from the biological material can be a viable approach to diagnosis, especially when performed in extrapulmonary samples.

Orientador: Paulo José Fortes Villas Bôas / Coorientador: Adriana Polachini do Valle / Resumo: Estima-se que um em cada quatro brasileiros esteja infectado pelo bacilo de Koch, e apenas em 2013, 80 mil casos de tuberculose foram notificados ao Ministério da Saúde, dos quais 6,5 mil foram a óbito. O exame laboratorial para o diagnóstico da tuberculose é feito pelos seguintes métodos tradicionais: Baciloscopia (BAAR) e Cultura, considerada o padrão ouro, porém com um tempo de realização demorado (em torno de oito semanas). A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é um método de amplificação de DNA que pode ser útil no diagnóstico diferencial da tuberculose com outras infecções pulmonares. Além disso, a PCR pode confirmar a identificação da micobactéria em materiais clínicos que apresentem uma difícil positividade. Objetivos - Avaliar a positividade de Mycobacterium spp. em diferentes materiais biológicos utilizando a técnica de PCR para os alvos Internal Transcribed Spacer (ITS) 16S-23S rDNA e gene hsp 65. Material e métodos - Cento e trinta materiais biológicos de pacientes com suspeita de tuberculose pulmonar ou extrapulmonar foram investigados para pesquisa de Mycobacterium spp. por ITS-PCR e pesquisa de fragmento do gene hsp65, no período de março de 2012 a abril de 2013. Para identificação das espécies de micobactérias foi utilizada a pesquisa do gene IS6110, e técnica Restriction Enzyme Pattern Analysis (PCR-PRA). Para algumas amostras positivas pela PCR foi realizado o sequenciamento para identificação da espécie. Foram avaliados dados demográficos e condições ass... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: It is estimated that one in every four Brazilians is infected with Koch's bacillus, and just in 2013, eighty thousand cases of tuberculosis were reported to the Department of Health, of which 6.5 million died. The laboratory test for the diagnosis of tuberculosis is made by the following traditional methods: baciloscopy and culture, considered the gold standard, but with a long holding time (around 8 weeks). Polymerase chain reaction (PCR) is a DNA amplification method that can be useful in the differential diagnosis of pulmonary tuberculosis with other infections. In addition, PCR can confirm the identification of mycobacteria in clinical materials that exhibit a difficult positivity. Objectives - To evaluate the positivity of Mycobacterium spp. in different biological materials using the PCR technique for the Internal Transcribed Spacer (ITS) 16S-23S rDNA gene and hsp 65 targets. Materials and Methods - One hundred and thirty biological materials of patients with suspected pulmonary or extrapulmonary tuberculosis were investigated for Mycobacterium tuberculosis spp. by ITS-PCR research and gene fragment hsp65 research, from March 2012 to April 2013. To identify the species of mycobacteria was used the IS6110 gene research and PCR-PRA technique). For some positive samples was performed by PCR sequencing to species identification. They evaluated demographics and associated conditions. The comparison between the techniques was checked by χ² test. The samples surveyed in sput... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

As micobactérias compreendem um grupo de organismos que são heterogêneos em termos de metabolismo, crescimento, nicho ambiental, epidemiologia, patogenicidade, distribuição geográfica e associação com doenças. O diagnóstico micobacteriológico é atualmente um desafio aos laboratórios. Com a descrição de novas espécies de micobactérias nos últimos anos, tem sido cada vez mais difícil identificar com precisão estas espécies. Uma questão básica na identificação em micobactérias é a diferenciação entre o Complexo Mycobacterium tuberculosis e as Micobactérias Não Causadoras de Tuberculose (MNT); no entanto tem sido cada vez mais importante a diferenciação das MNT. Em virtude das semelhanças fenotípicas e genotípicas, é necessário a aplicação e desenvolvimento de metodologias que melhor caracterizem as MNT para que seja possível determinar de forma mais precisa a prevalência das diferentes espécies. Além disso, diferentes espécies de MNT podem apresentar diferenças no perfil de sensibilidade às drogas terapêuticas, sendo que a identificação precisa é crucial para a adoção de terapia medicamentosa adequada. O objetivo deste trabalho foi caracterizar os isolados de MNT através da comparação entre duas técnicas moleculares, a técnica de PRA-hsp65 e um kit comercial GenoType® Mycobacterium CM, usando o método de sequenciamento do gene hsp65 como padrãoouro. Foram analisadas 96 isolados e a concordância entre os resultados do PRA-hsp65 e do GenoType® Mycobacterium CM foi de 92%. O método molecular PRA-hsp65 mostrou-se eficaz na identificação das espécies em 91% das amostras e o GenoType® Mycobacterium CM em 92%. Em relação aos custos referentes aos dois métodos, foi possível estabelecer que o PRA-hsp65 apresentou um valor final consideravelmente inferior ao do GenoType® Mycobacterium CM. No entanto, a técnica comercial necessita um prazo mais curto (2 dias) para ser realizada em comparação com a técnica PRA-hsp65 (requer 5 dias). Na nossa avaliação, a aplicabilidade do PRA-hsp65 aumenta a qualidade e rapidez do resultado final, já que se mostrou discriminatório, de baixo custo e relativamente de fácil execução na identificação de micobactérias. É possível concluir que ambas as técnicas moleculares avaliadas neste estudo apresentaram uma ótima capacidade de identificação de MNT, sendo que a implementação destas técnicas dependerá das características dos diferentes laboratórios bem como as necessidades clínicas das diferentes instituições. / Mycobacteria comprise a group of organisms that are heterogeneous in terms of metabolism, growth, environmental niche, epidemiology, pathogenicity, geographic distribution and disease association. The laboratory diagnosis of mycobacteria is currently a challenge to laboratories. Due to the increased description of new species of mycobacteria in recent years it is becoming difficult to accurately identify these species. A basic question in the identification of mycobacteria is the differentiation between Mycobacterium tuberculosis and the Non-Tuberculous Mycobacteria (NTM); however it has been increasingly important to differentiate the NTM species. Due to the fact that there are phenotypic and genotypic similarities, it is necessary to apply and develop methodologies to better characterize the NTM to be able to determine more accurately the prevalence of different species. Furthermore, different NTM species may differ in the profile of sensitivity to therapeutic drugs, and accurate identification is crucial for the adoption of appropriate drug therapy. The objective of this study was to characterize NTM isolates by comparing two molecular techniques, the technique of PRA-hsp65 (PCR-Restriction Enzyme Analysis) and a commercial kit GenoType® Mycobacterium CM, using the sequencing the hsp65 gene as gold standard. We analyzed 96 samples and the concordance between the results of the PRA-hsp65 and the GenoType® Mycobacterium CM was 92%. The PRA-hsp65 molecular method proved to be effective in 91% of species identification and the GenoType® Mycobacterium CM in 92%. Regarding costs for the two methods, we could establish that the PRA-hsp65 had a final value considerably lower than the GenoType® Mycobacterium CM. However, the commercial technique requires a shorter period (2 days) to be performed in comparison with the technique PRA-hsp65 (requires five days). In our evaluation, the applicability of the PRA-hsp65 increases the quality and speed of the final result (in relation to traditional phenotypic identification or outsourcing in referral centers), and proved to be discriminatory, inexpensive and relatively easy to perform the identification of mycobacteria. Finally, we conclude that both molecular techniques evaluated in this study showed a great capacity for identification of NTM and that the implementation of these techniques. However, depend on the characteristics of different laboratories as well as the clinical needs of different institutions.

As micobactérias compreendem um grupo de organismos que são heterogêneos em termos de metabolismo, crescimento, nicho ambiental, epidemiologia, patogenicidade, distribuição geográfica e associação com doenças. O diagnóstico micobacteriológico é atualmente um desafio aos laboratórios. Com a descrição de novas espécies de micobactérias nos últimos anos, tem sido cada vez mais difícil identificar com precisão estas espécies. Uma questão básica na identificação em micobactérias é a diferenciação entre o Complexo Mycobacterium tuberculosis e as Micobactérias Não Causadoras de Tuberculose (MNT); no entanto tem sido cada vez mais importante a diferenciação das MNT. Em virtude das semelhanças fenotípicas e genotípicas, é necessário a aplicação e desenvolvimento de metodologias que melhor caracterizem as MNT para que seja possível determinar de forma mais precisa a prevalência das diferentes espécies. Além disso, diferentes espécies de MNT podem apresentar diferenças no perfil de sensibilidade às drogas terapêuticas, sendo que a identificação precisa é crucial para a adoção de terapia medicamentosa adequada. O objetivo deste trabalho foi caracterizar os isolados de MNT através da comparação entre duas técnicas moleculares, a técnica de PRA-hsp65 e um kit comercial GenoType® Mycobacterium CM, usando o método de sequenciamento do gene hsp65 como padrãoouro. Foram analisadas 96 isolados e a concordância entre os resultados do PRA-hsp65 e do GenoType® Mycobacterium CM foi de 92%. O método molecular PRA-hsp65 mostrou-se eficaz na identificação das espécies em 91% das amostras e o GenoType® Mycobacterium CM em 92%. Em relação aos custos referentes aos dois métodos, foi possível estabelecer que o PRA-hsp65 apresentou um valor final consideravelmente inferior ao do GenoType® Mycobacterium CM. No entanto, a técnica comercial necessita um prazo mais curto (2 dias) para ser realizada em comparação com a técnica PRA-hsp65 (requer 5 dias). Na nossa avaliação, a aplicabilidade do PRA-hsp65 aumenta a qualidade e rapidez do resultado final, já que se mostrou discriminatório, de baixo custo e relativamente de fácil execução na identificação de micobactérias. É possível concluir que ambas as técnicas moleculares avaliadas neste estudo apresentaram uma ótima capacidade de identificação de MNT, sendo que a implementação destas técnicas dependerá das características dos diferentes laboratórios bem como as necessidades clínicas das diferentes instituições. / Mycobacteria comprise a group of organisms that are heterogeneous in terms of metabolism, growth, environmental niche, epidemiology, pathogenicity, geographic distribution and disease association. The laboratory diagnosis of mycobacteria is currently a challenge to laboratories. Due to the increased description of new species of mycobacteria in recent years it is becoming difficult to accurately identify these species. A basic question in the identification of mycobacteria is the differentiation between Mycobacterium tuberculosis and the Non-Tuberculous Mycobacteria (NTM); however it has been increasingly important to differentiate the NTM species. Due to the fact that there are phenotypic and genotypic similarities, it is necessary to apply and develop methodologies to better characterize the NTM to be able to determine more accurately the prevalence of different species. Furthermore, different NTM species may differ in the profile of sensitivity to therapeutic drugs, and accurate identification is crucial for the adoption of appropriate drug therapy. The objective of this study was to characterize NTM isolates by comparing two molecular techniques, the technique of PRA-hsp65 (PCR-Restriction Enzyme Analysis) and a commercial kit GenoType® Mycobacterium CM, using the sequencing the hsp65 gene as gold standard. We analyzed 96 samples and the concordance between the results of the PRA-hsp65 and the GenoType® Mycobacterium CM was 92%. The PRA-hsp65 molecular method proved to be effective in 91% of species identification and the GenoType® Mycobacterium CM in 92%. Regarding costs for the two methods, we could establish that the PRA-hsp65 had a final value considerably lower than the GenoType® Mycobacterium CM. However, the commercial technique requires a shorter period (2 days) to be performed in comparison with the technique PRA-hsp65 (requires five days). In our evaluation, the applicability of the PRA-hsp65 increases the quality and speed of the final result (in relation to traditional phenotypic identification or outsourcing in referral centers), and proved to be discriminatory, inexpensive and relatively easy to perform the identification of mycobacteria. Finally, we conclude that both molecular techniques evaluated in this study showed a great capacity for identification of NTM and that the implementation of these techniques. However, depend on the characteristics of different laboratories as well as the clinical needs of different institutions.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-03-14T15:26:23Z No. of bitstreams: 1 romulotadeupacedeassislage.pdf: 8686289 bytes, checksum: e76b40cfa379f42f86828b9387fdbc74 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-03-16T13:11:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 romulotadeupacedeassislage.pdf: 8686289 bytes, checksum: e76b40cfa379f42f86828b9387fdbc74 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-16T13:11:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 romulotadeupacedeassislage.pdf: 8686289 bytes, checksum: e76b40cfa379f42f86828b9387fdbc74 (MD5) Previous issue date: 2016-08-25 / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / O objetivo desse trabalho foi pesquisar a ocorrência de Mycobacterium bovis, Micobactérias não tuberculosas (MNT) e Actinomicetos em Queijo Minas Artesanal (QMA) da microrregião do Serro. Avaliou-se a presença dos patógenos por meio de cultivo bacteriano em queijos com períodos de maturação em temperatura ambiente entre 4 e 8 dias, em queijarias certificadas ou cadastradas pelo Instituto Mineiro de Agropecuária (IMA), que possuem assim o aval do órgão para o comercio estadual. Todas as amostras de queijos foram provenientes de rebanhos submetidos ao teste de tuberculinização intradérmica comparada, conforme disposto no Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e da Tuberculose (PNCEBT), realizado por médico veterinário particular credenciado no programa, apresentando resultado negativo. Das amostras coletadas (n = 55), 4 (7,27%) apresentaram resultados positivos (4/55) para microrganismos de crescimento rápido em meio Stonebrink. Estes isolados das amostras de queijos positivas foram submetidos à amplificação gene hsp65 do DNA por PCR, sequenciamento de DNA e sua comparação com as sequencias depositadas no banco de dados “Basic Local Alignment Search Tool Nucleotide” (BLASTn), não restringindo a busca para gênero ou espécie. As sequências identificadas apresentaram maior similaridade com as espécies Mycobacterium novocastrense (uma amostra), Gordonia bronchiallis (três amostras). Não foram encontrados resultados positivos para M. bovis. Enfim, a presença de DNA de M. novocastrense e G bronchiallis nas amostras sugere necessidade de medidas de identificação e controle mais rigorosas, tanto em nível de rebanho como na matéria prima e no produto acabado. Essa lacuna na legislação seria algo para reflexão, dada a importância das micobactérias não tuberculosas e de outros Actinomicetos à saúde pública, principalmente quando destinados a grupos específicos como pacientes com imunossupressão. / The aim of this study was to estimate the occurrence of non-tuberculous Mycobacteria and other Actinomycetes in artisanal cheeses, named of “Queijo Minas Artesanal” (QMA), from Serro, a micro region of Minas Gerais state, Brazil. The presence of pathogens in cheeses with ripening between 4 and 8 days at room temperature means cultivation and molecular speciation methods was evaluated. QMA has been certified or registered by “Instituto Mineiro de Agropecuária (IMA)”, which has endorsed its interstate trade over the country. Of the samples collected (n = 55), 4 (7.27%) showed positive results (4/55) for fast-growing micro-organisms by means of bacterial culture. These isolates from cheeses positive samples were submitted to DNA amplification by PCR, DNA sequencing and its comparison with the sequences deposited in “Basic Local Alignment Search Tool Nucleotide” (BLASTn) database, not restricting the search to genus or species. The sequences identified presented higher similarity with Mycobacterium novocastrense (a sample), nontuberculous mycobacteria (NTM) and Gordonia bronchiallis (three samples) species. All samples of cheeses were from herds subject to intradermal comparative test, as provided by Brazilian programme for the control and eradication of brucellosis and tuberculosis, performed by private accredited veterinarian, showing negative results. Finally, the presence of DNA of Mycobacterium novocastrense and Gordonia bronchiallis in cheeses suggests a supposed disability in the current control of pathogens program, as well as the need for identification measures and stricter control, either at the level of flock as raw materials and the finished product. This gap in the legislation would be something for reflection, given the importance of NTM and other Actinomycetes to public health, especially when aimed at specific groups such as patients with immunosuppression.