Made available in DSpace on 2014-05-29T12:32:35Z (GMT). No. of bitstreams: 4
license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5)
69316.pdf: 16389099 bytes, checksum: 74eb72078f131d9d9be7efc37391f1e6 (MD5)
69316.pdf.txt: 484412 bytes, checksum: 46c33af71747059817ce7b4a20b609af (MD5)
69316.pdf.jpg: 1433 bytes, checksum: 084dde94865696f7af0cab1566875cf5 (MD5)
Previous issue date: 2014-05-06 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, é uma doença tropical negligenciada que representa um grave problema de saúde pública. Assim, compreender a biologia da interação T. cruzi-hospedeiros constitui um grande desafio, uma vez que o ciclo de vida deste parasito exige um repertório de adaptações para garantir sua dispersão em hospedeiros vertebrados e invertebrados. O presente estudo demonstra o potencial das proteínas com propriedade de ligação à heparina (PLHs) em atuar no ciclo biológico do T. cruzi. Durante este trabalho foi oportuno isolar uma fração de proteínas hidrofóbicas com propriedade de ligação à heparina, com massas moleculares entre 70 kDa e 59 kDa em formas epimastigotas e tripomastigotas de T. cruzi por cromatografia de afinidade à heparina. A presença destas proteínas na superfície celular destes parasitos foi confirmada por ressonância plasmônica de superfície. Tais ensaios também foram decisivos na determinação da especificidade e estabilidade da ligação das PLHs a heparina, heparam sulfato (HS) e condroitim sulfato (CS). Os ensaios de competição realizados indicaram que a interação entre PLHs e GAGs pode influenciar a adesão dos epimastigotas à superfície de células epiteliais do trato intestinal de Rhodnius prolixus
O envolvimento de GAGs na invasão de amastigotas em cardiomiócitos, célula alvo da infecção pelo T. cruzi, também foi demonstrado através de ensaios de competição com 20 \03BCg/ml de GAGs solúveis, incluindo heparina, HS, CS, dermatam sulfato (DS) e queratam sulfato (KS). Uma drástica redução no nível de infecção foi evidenciada apenas com heparina e HS, atingindo 82% e 65% de redução da invasão, respectivamente. Ensaios com células deficientes em GAGs (CHO-745) corroboraram o importante papel destes componentes de matriz extracelular no processo de reconhecimento e invasão de amastigotas. Na continuidade deste estudo, avançamos na caracterização bioquímica de PLHs, na determinação da expressão e distribuição espacial destas proteínas em tripomastigotas. As análises por citometria de fluxo revelaram que PLHs são abundantes na superfície de tripomastigotas, clone Dm28c, e a detecção destas proteínas por imunofluorescência indireta revelou uma localização predominante na membrana flagelar do parasito. Com os ensaios de zimografia realizados neste trabalho, revelamos que as PLHs de tripomastigotas tem atividade de protease sobre gelatina em uma ampla faixa de pH (5,5 - 8,0). A sensibilidade destas enzimas a presença de inibidores de serino protease indicam que as PLHs de tripomastigotas têm propriedades similares à tripsina. O conjunto de resultados deste trabalho aponta para o importante papel das PLHs em todas as etapas do ciclo biológico do T. cruzi a partir de eventos de adesão e invasão celular, através do reconhecimento de glicosaminoglicanos sulfatados / Chagas disease, caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, is a neglected
tropical disease that causes a serious public health problem. Thus, understanding the
biology of the T. cruzi-hosts interaction is a major challenge, since the life cycle of this
parasite requires a repertoire of adaptations to ensure their dispersion in vertebrate
and invertebrate hosts. The present study demonstrates the potential of proteins with
heparin-binding property (HBPs) to act in the biological cycle of T. cruzi.
During this study, it was opportune to isolate a hydrophobic protein fraction with
property to bind to heparin, with molecular weights ranging from 70 kDa to 59 kDa, in
epimastigotes and trypomastigotes of T. cruzi by heparin affinity chromatography. The
presence of these proteins on the cell surface of these parasites was confirmed by
surface plasmon resonance. These assays were also decisive in determining the
specificity and stability of the binding of HBPs to heparin, heparan sulfate (HS) and
chondroitin sulfate (CS). The competition assays indicated that the interaction between
HBPs and GAGs can influence the adhesion of the epimastigote to the surface of
epithelial cells of the intestinal tract of Rhodnius prolixus.
The involvement of GAGs in the invasion of amastigotes in cardiomyocytes, target
cell of T. cruzi infection, was also demonstrated by competition assays with 20 μg/ml of
soluble GAGs, including heparin, HS, CS, dermatan sulfate (DS) and keratan sulfate
(KS). A drastic reduction in the level of infection was observed only with heparin and
HS, reaching 82% and 65% reduction of the invasion, respectively. Experimental
assays using cells deficient in GAGs (CHO-745) corroborated the important role of
extracellular matrix components in the recognition and invasion of amastigotes.
In continuation of this study, we advanced in the biochemical characterization of
HBPs and also determined the expression and spatial distribution of these proteins in
trypomastigotes. The flow cytometric analysis revealed that HBPs are abundant at the
surface of trypomastigotes, Dm28c clone, and the detection of these proteins by
indirect immunofluorescence revealed a predominant location in the flagellar
membrane of the parasite. With the zymography assays conducted in this work, we
revealed that HBPs of trypomastigotes have proteinase activity on gelatin in a wide pH
range (5.5 - 8.0). The sensitivity of these enzymes in the presence of serine proteinase
inhibitors indicates that HBPs of trypomastigotes have properties similar to trypsin. All
together, the results of this study points out to the important role of HBPs at all stages
of the life cycle of T. cruzi from events of adhesion and cell invasion, through the
recognition of sulfated glycosaminoglycans
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/7704 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Oliveira Junior, Francisco Odencio Rodrigues de |
| Contributors | Soares, Maurilio José, Mallet, Jacenir Reis dos Santos, Vermelho, Alane Beatriz, Pons, Andrea Henriques, Silva Junior, Floriano Paes, Pereira, Mirian Claudia de Souza, Alves, Carlos Roberto |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0027 seconds