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Previous issue date: 2014-11-18 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Várias populações de Aedes aegypti, vetor da dengue e da febre amarela urbana, apresentaram resistência aos inseticidas clássicos utilizados em seu controle. Sendo assim, torna-se imperativo o estabelecimento de estratégias alternativas. Nesse sentido, a biossíntese de quitina é um alvo potencial. Em artrópodes, a quitina é considerada o principal constituinte da cutícula (ou exoesqueleto). A quitina Sintase (do inglês Chitin Synthase, CHS) é uma enzima-chave na biossíntese desta molécula, e os compostos benzoil-fenil-uréias (BPUs) possuem atividade inibidora da síntese de quitina, interferindo na formação da cutícula em diversas espécies de insetos. Novaluron é um BPU recentemente recomendado pela WHO para uso em água potável, o que o qualifica como uma alternativa viável para o controle de larvas do vetor da dengue. Neste trabalho investigamos, durante o desenvolvimento larvar de Ae. aegypti, a influência de novaluron sobre: 1) o conteúdo de quitina; 2) a expressão do gene AaCHS1, evidenciada por seus transcritos alternativos AaCHS1a e AaCHS1b e, 3) a estrutura do exoesqueleto e da membrana peritrófica. Para tanto, inicialmente foi necessário observar os momentos das ecdises larvais. Os pontos definidos para a coleta das amostras levaram em conta o processo de síntese de cutícula a cada instar larvar. Foram escolhidos pontos tentativamente representativos do início (i), meio (int) e fim (f) do terceiro (L3) e do quarto (L4) instares. Os pontos de L3i, L3int, L3f, L4i, L4int e L4f foram definidos como 53, 59,5, 68, 75, 92,5 e 98 horas após a eclosão (HAE), respectivamente.
Novaluron foi então administrado continuamente a larvas L3, a partir de 51 HAE, em concentrações definidas em relação ao seu percentual de inibição de emergência do adulto (IE): IE20, IE50 e IE99. Foi observado um aumento significativo no conteúdo de quitina de larvas controle, desde L3i até L4f. Novaluron afetou significativamente a produção de quitina de forma dose-dependente, ao longo do desenvolvimento larvar. A abundância relativa de mRNA dos transcritos AaCHS1a e AaCHS1b foi avaliada por PRC quantitativo em tempo real, de L3i e L4f, em larvas controle e tratadas com dose de IE99. O perfil de expressão dos transcritos AaCHS1a e AaCHS1b é similar em larvas controle, ainda que a variação temporal de AaCHS1b seja maior. O BPU parece ter um efeito mais proeminente sobre o perfil de expressão de AaCHS1b, que se acentua nas primeiras horas após tratamento. Com base nos resultados obtidos, duas hipóteses são discutidas: mecanismo de feedback positivo ou atraso fisiológico do desenvolvimento. Ensaios histológicos preliminares validaram a metodologia utilizada para preparo e observação da morfologia de larvas tratadas e controle. Cortes longitudinais evidenciaram a preservação de estruturas internas, inclusive as quitinosas, o que abre a perspectiva de ensaios futuros de marcação específica para quitina / Several populations of
Aedes aegypti
, vector of dengue and urban yellow fever, exhibit
resistance to insecticides used on their control. T
herefore, the establishment of alternative strategi
es
becomes imperative. In this regard, chitin biosynth
esis is a potential target. In arthropods, chitin i
s
considered the main constituent of the cuticle (or
exoskeleton). Chitin Synthase (CHS) is a key
enzyme in the biosynthesis of this molecule and, Be
nzoyl-phenyl-urea (BPU) compounds inhibit chitin
synthesis, interfering with cuticle formation in se
veral insect species. Novaluron was recently
recommended by WHO for use in potable water, which
qualifies this BPU as a viable alternative to the
control of the dengue vector larvae. In the present
work we investigated the influence of novaluron,
during larval development of
Ae. aegypti
, on the: 1) chitin content, 2)
AaCHS1
gene expression,
through its alternative spliced forms
AaCHS1a
and
AaCHS1b
, and 3) exoskeleton and peritrophic
membrane structure. For this purpose, it was first
necessary to observe the timing of larval ecdysis.
The time points selected for sampling took into acc
ount the process of cuticle synthesis at each larva
l
instar. Tentative initial (i), intermediary (int) a
nd final (f) representative time points were chosen
for the
third (L3) and fourth (L4) larval instars. The poin
ts of L3i, L3int, L3f, L4i, L4int and L4f were defi
ned as
53, 59.5, 68, 75, 92.5 and 98 hours after hatching
(HAH), respectively. Novaluron was continuously
administered to L3 larvae, from 51 HAH on at concen
trations defined with respect to the percentage of
adult emergence inhibition (EI): EI
20
, EI
50
and EI
99
. In control larvae, a significant increase of the
chitin
content, from L3i until L4f, was observed. Novaluro
n significantly affected chitin production in a dos
e
dependent manner, during larval development. The re
lative abundance of
AaCHS1a
and
AaCHS1b
transcripts was evaluated by quantitative real time
PCR, from L3i to L4f, on both control and novaluro
n
IE
99
larvae. The expression of
AaCHS1a
the treated larvae were similar to control. The ex
pression
profile of both
AaCHS1a
and
AaCHS1b
transcripts is similar in control larvae, even if
variations in
AaCHS1b
are higher. BPU treatment effect seems more pronou
nced on
AaCHS1b
expression profile,
that is activated in the first hours immediately fo
llowing treatment. Two hypotheses are raised: a
positive feedback mechanism or a physiological deve
lopment delay. Preliminary histological
observations validated the methodology employed for
preparing and observing control and treated
larvae morphology. Longitudinal sections put in evi
dence the preservation of internal structures,
including chitinized ones, opening the perspective
of future assays for specific chitin.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/9101 |
| Date | January 2009 |
| Creators | Ferreira, Luana Cristina Farnesi |
| Contributors | Oliveira, Ricardo Lourenço de, Sorgine, Marcos Henrique Ferreira, Fragoso, Stênio Perdigão, Bruno, Rafaela Vieira, Ehlers, Samira Chahad, Valle, Denise, Pelajo-Machado, Marcelo |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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