FROTA, I. M. A. Estabilidade de genes de referência e influência das BMPs-6 e 7 sobre o desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais caprinos. 2010. 114 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará. 2010. / Submitted by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-04-04T14:52:49Z
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Previous issue date: 2010 / This study aims to evaluate the stability of reference genes and the expression of growth
factors and hormone receptors in goat secondary follicles. It also seeks to quantify the
expression of messenger RNA for BMP-6 and BMP-7 in goat preantral follicles and to
evaluate the effects of FSH, BMP-6 and BMP-7 on growth and gene expression in secondary
follicles goats after 6 days of culture. To evaluate the stability of reference genes, secondary
follicles (150-200 μm) were mechanically isolated from goat ovaries. After extraction of total
RNA and synthesis of complementary DNA, the quantification of mRNA was carried out by
real-time PCR using specific primers for genes of reference (GAPDH, β-tubulin, β-actin,
PGK, UBQ, RPL - 19, rRNA18S), growth factors (GDF-9, BMP-15, BMP-6, FGF-2, VEGF,
KL and IGF-1) and hormone receptor (FSH-R, LH-R and GH-R). To evaluate expression of
BMP-6 and BMP-7, primordial follicles, primary and secondary as well as small and large
antral follicles were obtained and the mRNA levels of BMP-6 and 7 were measured. For in
vitro studies, the effects of BMP-6 (50 ng / mL) and BMP-7 (50 ng / mL) in the presence or
absence of FSH (50 ng / mL) on the development of secondary follicles and on the expression
of mRNA for BMP-6 and 7 and FSH-R was evaluated after 6 days of culture. Results showed
that mRNA for growth factors (EGF, GDF-9, BMP-15, VEGF, FGF-2, BMP-6, IGF-1 and
KL) and the receptors for FSH, LH and GH are expressed in at different levels in preantral
follicles of goats. Moreover, among the growth factors studied, IGF-1 and EGF had higher
and lower levels or RNA, respectively. UBQ and β-actin genes were the mostr stable
reference in fresh and cultured preantral follicles. The level of mRNA for BMP-6 in primary
and secondary follicles was significantly higher than those in primordial follicles, while the
levels of mRNA for BMP-7 was higher in granulosa cells / theca in large antral follicles than
in small antral follicles. After culture of secondary follicles for 6 days, FSH increased
follicular diameter and FSH and BMP-7 significantly increased the levels of mRNA for BMP-
7 and FSH-R. In addition, BMP-6 in the presence or absence of FSH increased the diameter
of secondary follicles after 6 days of culture. Real-time PCR shoed that FSH increased the
levels of mRNA for BMP-6, while both BMP-6 and FSH and increased levels of mRNA for
FSH-R, after a period of 6 days of culture. In conclusion, UBQ and β-actin are the two most
stable genes for secondary follicles goats and FSH and BMPs of types 6 and 7 stimulate the
growth of preantral follicles after 6 days of in vitro culture. / Este trabalho tem como objetivo avaliar a estabilidade de genes de referência e a expressão de fatores de crescimento e de receptores de hormônios em folículos secundários de caprinos. Além disso, visa quantificar a expressão dos RNA mensageiros para BMP-6 e BMP-7 em folículos pré-antrais e antrais caprinos e avaliar os efeitos de FSH, BMP-6 e BMP-7 sobre o crescimento e expressão gênica em folículos secundários caprinos durante 6 dias de cultivo. Para avaliar a estabilidade dos genes de referência, folículos secundários (150-200 µm) foram isolados mecanicamente de ovários caprinos. Após a extração do RNA total e síntese de DNA complementar, realizou a quantificação dos mRNA, por PCR em tempo real, utilizando-se primers específicos para genes de referência (GAPDH, β-tubulina, β-actina, PGK, UBQ, RPL-19, rRNA18S), fatores de crescimento (GDF-9, BMP-15, BMP-6, FGF-2, VEGF, KL e IGF-1) e receptores de hormônio (FSH-R, LH-R e GH-R). Para avaliar a expressão de BMP-6 e BMP-7, folículos primordiais, primários e secundários, bem como pequenos e grandes folículos antrais foram obtidos e os níveis de mRNA de BMP-6 e 7 foram quantificados. Nos estudos in vitro, os efeitos da BMP-6 (50 ng/mL) e BMP-7 (50 ng/mL) na presença ou ausência de FSH (50 ng/mL) sobre o desenvolvimento in vitro de folículos secundários e sobre a expressão de mRNA para BMP-6 e 7 e FSH-R foi avaliada após 6 dias de cultivo. Os resultados mostraram que UBQ e β-actina são os genes de referência mais estáveis em folículos pré-antrais caprinos fresco cultivados por 12 dias. Os RNAs mensageiros para os fatores de crescimento (EGF, GDF-9, BMP-15, VEGF, FGF-2, BMP-6, IGF-1 e KL) e os receptores de FSH, LH e GH são expressos em diferentes níveis em folículos pré-antrais de caprinos, sendo que o IGF-1 e o EGF apresentaram, respectivamente, o maior e o menor nível de mRNA. O nível de mRNA para BMP-6 em folículos primários e secundários foi significativamente maior do que aqueles em primordial, enquanto que os níveis de mRNA para BMP-7 foi maior nas células da granulosa/teca de grandes do que nos pequenos folículos antrais. Após o cultivo de folículos secundários durante 6 dias, FSH aumentou o diâmetro folicular e FSH e BMP-7 aumentou significativamente os níveis de mRNA para BMP-7 e FSH-R. Já a BMP-6 na presença ou ausência de FSH aumentou o diâmetro dos folículos secundários. Além disso, FSH aumentou os níveis de mRNA para BMP-6, enquanto ambos BMP-6 e FSH e aumentaram os níveis de mRNA para FSH-R, após o período de cultivo. Em conclusão, UBQ e β-actina são os dois genes mais estáveis para folículos secundários caprinos e o FSH e as BMPs dos tipos 6 e 7 estimulam o crescimento de folículos pré-antrais in vitro durante 6 dias de cultivo.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.repositorio.ufc.br:riufc/16029 |
| Date | January 2010 |
| Creators | Frota, Isana Mara Aragão |
| Contributors | Silva, José Roberto Viana |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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