Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Eudistoma vannamei (Millar, 1977) à uma ascÃdia endÃmica do litoral do Nordeste brasileiro, largamente encontrado nas praias rochosas do estado do CearÃ. Previamente, o extrato bruto apresentou um interessante perfil em termos de bioatividade. O fracionamento bioguiado identificou uma mistura 1:1 altamente citotÃxica, contendo dois derivados inÃditos de estaurosporina, 2-hidroxi-7-oxoestaurosporina (I) e 3-hidroxi-7-oxoestaurosporina (II). IC50 para I/II e estaurosporina (STP) foram obtidas apÃs 72h de incubaÃÃo com diversas linhagens de cÃlulas tumorais, utilizando-se o ensaio do MTT, e em linfÃcitos humanos normais, atravÃs do ensaio de AlamarBlue. I/II superou a citotoxicidade de STP em 7 vezes, em mÃdia, para as cÃlulas tumorais, ao passo que mostrou-se tÃo ativa quanto frente Ãs cÃlulas normais. Uma anÃlise cinÃtica sobre a progressÃo de ciclo celular, ativaÃÃo de resposta a dano e vias de reparo de DNA, e induÃÃo de apoptose de cÃlulas HL-60 (leucemia) foi conduzida com 40 ou 80ng/mL I/II e acessada por citometria de fluxo e western blotting. Estudos de ciclo celular indicaram que I/II (40ng/mL) induz bloqueio de ciclo celular em G2/M e que este efeito prossegue irreversÃvel mediante a remoÃÃo do estÃmulo. STP (200ng/mL) induziu o bloqueio quase que completo em G2/M apÃs 24h de incubaÃÃo, enquanto perÃodos mais longos de incubaÃÃo provocam um aumento substancial de cÃlulas poliplÃides. A expressÃo de proteÃnas envolvidas no controle do ciclo celular (Cdk1, Cdk2, ciclina A e ciclina B1), associada à observaÃÃo morfolÃgica de cÃlulas tratadas com 40ng/mL I/II e coradas com H/E em lÃminas de vidro sugere que o bloqueio està ocorrendo, de fato, na fase G2. O bloqueio em G2 foi parcamente observado em cÃlulas tratadas com 80ng/mL I/II, conquanto caracterÃsticas apoptÃticas fizeram-se deveras evidentes. A avaliaÃÃo de dano à fita dupla de DNA atravÃs do teste do cometa neutro indica a induÃÃo apenas de baixo nÃvel de dano de DNA em cÃlulas tratadas com 40ng/mL I/II por 24, 48 ou 72h. Entretanto, cÃlulas tratadas com 80ng/mL I/II exibiram nÃveis mais elevados de dano. A expressÃo de proteÃnas relacionadas a dano de DNA (ATM e H2A.X) deu-se numa forma tempo- e concentraÃÃo-dependente, enquanto o bloqueio de ciclo e os marcadores de reparo (Chk1, Cdc25C, BRCA1) foram ativados, predominantemente, em cÃlulas tratadas com 40ng/mL I/II. Inversamente, a externalizaÃÃo de PS e a ativaÃÃo das caspases efetoras 3 e 7 e de PARP mostraram-se altamente expressos em cÃlulas tratadas com 80ng/mL I/II mostrou um claro efeito citostÃtico em cÃlulas HL-60 na menor concentraÃÃo testada, evidenciado pelo persistente bloqueio de ciclo celular e baixo dano em DNA; e um objetivo efeito citotÃxico na concentraÃÃo maior, motivado pelo extensivo dano em DNA e induÃÃo de apoptose. / Eudistoma vannamei Millar, 1977 is an endemic tunicate from the northeastern Brazilian coast, widely distributed over the rocky beaches of Cearà State. Previously, the crude extract showed an interesting bioactivity profile. Bioassay-guided fractionation yielded a highly cytotoxic 1:1 mixture identified as two novel staurosporine derivatives, 2-hydroxy-7-oxostaurosporine (I) and 3-hydroxy-7-oxostaurosporine (II). IC50 for I/II and staurosporine (STP) were obtained after 72h incubation with various tumor cell lines using the MTT assay and in normal human lymphocytes, by the AlamarBlue assay, where I/II outperformed STP in a 7-fold average. On normal cells, I/II showed to be equally effective as STP and, thus, showed a 25-fold average selectivity towards tumor cells. A kinetic analysis on cell cycle progression, activation of DNA damage and repair pathways and apoptosis induction of HL-60 cells (leukemia), was carried out with 40 or 80ng/mL I/II and accessed by flow cytometry and western blotting. Cell cycle studies indicated that I/II induces a G2-M arrest (at 40ng/mL, 45, 63 and 94% of arrested cells after 24, 48 and 72h treatment, respectively, against 9, 10 and 13% for the non-treated culture). Moreover, 24h-G2/M arrest is sustained and irreversible following removal of stimuli. STP induces 83% G2/M arrest at 200ng/mL after 24h incubation, whilst longer incubation periods provoke a substantial increase in polyploidy. Expression-rate of cell cycle related proteins (Cdk1, Cdk2, cyclin A and cyclin B1) paired with morphological observation of 40ng/mL I/II-treated H/E-stained cells placed on glass slides suggest that arrest is actually occurring at the G2 phase. G2 arrest is merely seen in 80ng/mL I/II-treated cells, while apoptotic features were quite evident. Double-strand breaks evaluated by the neutral comet assay indicates only low scored DNA damage against 24, 48 or 72h 40ng/mL I/II treated cells. However, 80ng/mL I/II-treated cells exhibited higher scored damage. DNA damage proteins (ATM and H2A.X) were expressed in a time- and concentration-dependent manner; while, cycle arrest and repair markers (Chk1, Cdc25C, BRCA1) were activated mostly on 40ng/mL I/II-treated cells. Conversely, PS externalization and activation of effector caspases 3 and 7 and PARP were highly blotted mostly for 80ng/mL I/II-treated cells. I/II induced a clear cytostatic effect on HL-60 cells at the lower concentration, distinguished by persistent cell cycle arrest and low DNA damage; and an objective cytotoxic effect at the higher concentration, motivated by extensive DNA damage and induction of apoptosis.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.teses.ufc.br:2963 |
| Date | 15 July 2009 |
| Creators | Paula Christine Jimenez |
| Contributors | LetÃcia Veras Costa-Lotufo, Eduardo MagalhÃes Rego, GlÃucia Maria Machado Santelli, Vietla Satyanarayana Rao, Manoel Odorico de Moraes Filho |
| Publisher | Universidade Federal do CearÃ, Programa de PÃs-GraduaÃÃo em Farmacologia, UFC, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Unknown |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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