CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Cryptostegia grandiflora R. Br. à um arbusto da famÃlia Apocynaceae conhecida popularmente como âunha de bruxaâ. O lÃtex dessa espÃcie à pouco estudado e ensaios preliminares jà haviam demonstrado a sua aÃÃo sobre o vetor da dengue. Dessa forma, este trabalho teve como objetivo caracterizar o lÃtex de Cr. grandiflora quanto as suas propriedades bioquÃmicas e avaliar a aÃÃo de suas proteÃnas contra o Aedes aegypti. ApÃs a coleta, o lÃtex foi separado em duas fraÃÃes, uma insolÃvel constituÃda por borracha (97%) e uma solÃvel contendo proteÃnas (3%). AnÃlises por eletroforese demonstraram a presenÃa de proteÃnas de variadas massas moleculares, cujo perfil foi completamente alterado apÃs tratamento com agente redutor e predominÃncia de proteÃnas Ãcidas com pI inferior a 5,0 (59%). Algumas proteÃnas da fraÃÃo solÃvel foram detectadas na borracha apÃs extraÃÃo com soluÃÃes Ãcidas, bÃsicas e salinas. Na fraÃÃo protÃica foram detectadas glicoproteÃnas, atividade quitinolÃtica (58,68  4,45 nKat/Âg) e de enzimas antioxidantes tais como Catalase (0,254  0,03 ÂMol H2O2/min g), SuperÃxido Dismutase (886,36  0,35 UA/g) e Peroxidase do Ascorbato (0,389  0,03 ÂMol H2O2/min g). As proteÃnas do lÃtex tambÃm apresentaram forte atividade proteolÃtica em pH 5,0 (5,43 UA/μgP) a qual foi aumentada 6,13 UA/μgP apÃs ativaÃÃo com o agente redutor DTT. A forte atividade proteolÃtica com o substrato BANA (20,95 UA/μgP) e a inibiÃÃo da mesma na presenÃa dos inibidores especÃficos E-64 e IAA demonstrou a predominÃncia de proteases cisteÃnicas no lÃtex. Proteases serÃnicas, aspÃrticas e metaloproteases nÃo foram detectadas. A atividade proteolÃtica foi resistente a altas temperaturas, persistindo em 50 % apÃs 30 min a 75 ÂC. Inibidores de papaÃna e tripsina parecem ocorrer no lÃtex visto que a atividade destas enzimas foi praticamente eliminada quando incubadas previamente com a fraÃÃo protÃica sem atividade proteolÃtica. O fracionamento das proteÃnas do lÃtex atravÃs de cromatografia de troca iÃnica (DEAE- Sepharose Fast-flow, pH 5,0) gerou dois picos. A atividade proteolÃtica ficou concentrada nas proteÃnas nÃo retidas e foi residual no pico retido eluÃdo em NaCl 1M. Os ensaios biolÃgicos mostraram que a fraÃÃo protÃica nÃo foi capaz de inibir a eclosÃo de ovos do mosquito da dengue atà 24h, no entanto, foi capaz de interferir no desenvolvimento larval acarretando em 60% de mortalidade apÃs 72h. A mortalidade de larvas de terceiro estÃgio causada pela fraÃÃo protÃica (96,66%) aumentou apÃs tratamento com DTT (100%) e foi reduzida apÃs tratamento com os inibidores de proteases cisteÃnicas E-64 (36,66%) e IAA (21,42%). A atividade larvicida foi detectada apenas no pico cromatogrÃfico que concentrava a atividade proteolÃtica. Proteases comerciais inespecÃfica (pronase) e do tipo serÃnicas (tripsina e quimotripsina) nÃo foram tÃxicas para as larvas mesmo em concentraÃÃes iguais as da protease cisteÃnica papaÃna que apresentou aÃÃo tÃxica. BromelaÃna tambÃm nÃo apresentou atividade larvicida. Fotomicrografia das larvas submetidas aos diversos tratamentos nÃo evidenciou nenhum dano morfolÃgico embora tenha sido observada hipertrofia dos segmentos abdominais. Houve alteraÃÃo no perfil eletroforÃtico das proteÃnas larvais incubadas com a fraÃÃo protÃica do lÃtex e proteases comerciais (papaÃna, tripsina e quimotripsina). AtravÃs de anÃlise por microscopia de fluorescÃncia foi observada a presenÃa de proteÃnas em toda a estrutura larval, com algumas distinÃÃes entre as trÃs fraÃÃes protÃicas de lÃtex avaliadas. As proteÃnas do lÃtex nÃo apresentaram atividade inibitÃria contra os vÃrus da dengue tipos 1, 2 e 3. A aÃÃo tÃxica aguda em camundongos nÃo foi evidente em doses de atà 100 mg/kg peso corpÃreo, no entanto, a dose de 1000 mg/kg apresentou 33,33% de mortalidade atà 24h. Esse trabalho mostrou que as proteÃnas do lÃtex de Cr. grandiflora possuem forte efeito larvicida sobre Ae. aegypti e a atividade proteolÃtica do tipo cisteÃnica parece estar correlacionada com os efeitos deletÃrios observados, entretanto, alÃm das proteases outras proteÃnas podem estar envolvidas na toxicidade sobre as larvas. / Cryptostegia grandiflora R. Br. is a shurb belonging to Apocynaceae family popularly known as âunha de bruxaâ. There are few studies available about the latex from this species and preliminary assays had shown its action against Dengue vector. Thus, this study aimed to characterize the biochemical properties of Cr. grandiflora latex and to evaluate the action of its proteins against Aedes aegypti. After collected the latex was separated into two fractions one consisting of insoluble rubber (97%) and another containing soluble proteins (3%). Electrophoretic analysis showed the presence of proteins of several molecular weights whose profile has changed completely after treatment with reducing agent and predominance of acidic proteins with pI less than 5.0 (59%). Proteins from soluble fraction were also detected in the rubber fraction after extraction with acidic, basic and saline solutions. In the protein fraction were detected glycoproteins, chitinolytic activity (58.68  4.45 nKat/Âg) and antioxidant enzymes such as catalase (0.254  0.03 ÂMol H2O2/min g), superoxide dismutase (886.36  0.35 UA/g) and ascorbate peroxidase (0.389  0.03 ÂMol H2O2/min g). Latex proteins also showed strong proteolytic activity at pH 5.0 (5.43 UA/μgP) which was increased to 6.13 UA/μgP after activation by the reducing agent DTT. The strong proteolytic activity with BANA (20.95 UA/μgP) and inhibition of the same in the presence of specific inhibitors E-64 and IAA showed the predominance of cysteine proteases in latex. Serine, aspartic and metalloproteases were not detected. The proteolytic activity was resistant to high temperatures, remaining at 50% after 30 min ate 75. Papain and trypsin inhibitors seem to occur in the latex as the activity of these enzymes was virtually eliminated when previously incubated with protein fraction devoid of endogenous proteases. When fractioned by ion exchange chromatography (DEAE-Sepharose Fast-flow; pH 5.0) the protein fraction produced two peaks. The proteolytic activity was concentrated in non-retained proteins and residual in retained proteins eluted with 1M NaCl. Biological assays showed that the protein fraction was not able to inhibit egg hatching until 24h, however, it was able to interefere upon larval development (60% of mortality after 72h). Larval mortality caused by protein fraction (96.66%) increased after treatment with DTT (100%) and was reduced after treatment with cysteine protease inhibitors E-64 (36.66%) and IAA (21.42%). The larvicidal activity was detected only in the chromatographic peak which concentrated proteolytic activity. Purified non-specific (pronase) and serine proteases (trypsin and chymotrypsin) were not toxic to the larvae even at concentrations equal to those of the cysteine protease papain that showed toxic action. Bromelain also had no larvicidal activity. Photomicrography of larvae subjected to various treatments did not evidence any morphological damage although hypertrophy of abdominal segments was observed. There were alterations in the electrophoretic profile of proteins larval incubated with protein fraction of latex and purified proteases. Larvae exposed to FITC-PL exhibited fluorescence throughout the body and only discrete differences were documented. Latex proteins did not exhibit inhibitory activity against Dengue virus type 1, 2 and 3. The acute toxic action in mice was not evident at doses up to 100 mg / kg body weight, however, the dose of 1000 mg / kg showed 33.33% mortality within 24h. This study showed that proteins from Cr. grandiflora latex have strong larvicidal effect against Ae. aegypti and proteolytic activity of cysteine type seems to be correlated with the deleterious effects observed, however, in addition to proteases other proteins may be involved in toxicity upon larvae.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.teses.ufc.br:3646 |
| Date | 25 February 2010 |
| Creators | Mariana Giovenardi Cavalheiro |
| Contributors | MÃrcio Viana Ramos, Ana de FÃtima Fontenele Urano Carvalho |
| Publisher | Universidade Federal do CearÃ, Programa de PÃs-GraduaÃÃo em BioquÃmica, UFC, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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