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Previous issue date: 2011 / Diagnostic methods of TB, nowadays, are prone to delay in diagnosis, increased false negative results and are not sensitive to many forms of paucibacillary disease. The aforementioned are critical since the infected individuals remain untreated in the community, increasing the likelihood of disease transmission and epidemic aggravation, which urges the need of new diagnostic methods. In this context, the aims of this study were to implement a quantitative nucleic acid-based diagnostic test for paucibacillary tuberculosis, enabling the identification and quantification of viable Mycobaterium tuberculosis (Mt) bacilli by fluorescence-assisted PCR, i. e., Real-Time PCR (RT PCR). The intergenic region of the inhA-mabA gene, which is single copy gene, was chosen as the target region to design specific primers and probes conjugated with fluorophores (TaqMan), because of its importance in the biosynthesis of mycolic acids. The construction of synthetic DNA flanking the target region served as standards for absolute quantification of nucleic acids. The DNA can remain intact after cell death, thus molecular diagnostic methods may overestimate the real number of viable cells in a sample. Cultures of Mt H37Rv were treated with different concentrations of EMA and PMA, DNA intercalating dyes that bind to the DNA of dead cells, rendering it insoluble, thus hampering its isolation. The concentration of 100μM PMA was chosen to treat sputum samples from patients with TB. Our method of diagnosis showed a broad sensitivity (96. 1%) when compared to samples of smear-positive sputum and it proved to be 47% more sensitive than Ziehl-Neelsen staining for smearnegative samples. / Nos tempos atuais, os métodos mais utilizados no diagnóstico da Tuberculose (TB) promovem um atraso inaceitável na liberação dos resultados, um elevado número de resultados falso-negativo e muitos não são sensíveis para formas paucibacilares da doença. Este fato se torna crítico uma vez que pacientes infectados continuam não tratados na comunidade aumentando a probabilidade de transmissão da doença e agravo da epidemia, o que corrobora a necessidade de aprimoramento ou desenvolvimento de novas metodologias. Diante deste fato, propusemos implementar um diagnóstico de DNA quantitativo para tuberculose paucibacilar, permitindo uma rápida identificação e quantificação de bacilos viáveis do Mycobacterium tuberculsosis (Mt) em amostras biológicas com o auxílio da PCR em Tempo Real (R-T PCR). A região intergênica do gene inhA-mabA, possui cópia única no genoma do Mt e devido à sua importância na biossíntese de ácidos micólicos, foi escolhida como região alvo para o desenho de primers e sondas específicos acoplados a fluoróforos (TaqMan). A construção de padrões de DNA sintéticos do Mt serviram como referência para a quantificação absoluta dos ácidos nucleicos, com alvo na região intergênica descrita acima. Eles foram amplificados do DNA genômico do Mt utilizando primers específicos, clonados e o DNA plasmidial foi purificado e quantificado para o desenvolvimento de uma curva padrão. Após a morte celular o DNA pode permanecer íntegro; assim, métodos de diagnóstico molecular podem superestimar o número real de células viáveis em uma amostra. Culturas de Mt H37Rv foram tratadas com diferentes concentrações de EMA e PMA, intercalantes de DNA que se ligam no DNA de células mortas tornan-do o insolúvel e desta forma impedindo a sua amplificação. A concentração de 100OM de PMA foi escolhida para tratar amostras de escarro de pacientes em tratamento, ou com suspeita de TB. Nosso método de diagnóstico mostrou uma alta sensibilidade (96,1%) quando comparado a amostras de escarro com baciloscopia positiva e se mostrou 47% mais sensível que a coloração Ziehl-Neelsen para amostras com baciloscopia negativa.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/urn:repox.ist.utl.pt:RI_PUC_RS:oai:meriva.pucrs.br:10923/1375 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Assunção, Thiago Milech de |
| Contributors | Batista Junior, Eraldo Luiz |
| Publisher | Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da PUC_RS, instname:Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, instacron:PUC_RS |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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