Ticks are implicated in serious economic losses to animal production worldwide in
the order of billions of dollars. Although many antigens have been in vaccine tests,
none has been effective in the control of ticks, which justifies the development of
new antigens as well as new vaccine strategies. Phage Display techniques have
been widely employed to map epitope structures, which have served as the basis
for developing molecular vaccines. In the present study, we have applied this
technique to map specific epitopes of Rhipichephalus (Boophilus) microplus and to
validate the peptides as potential immunogens, we have adopted a process of
selection prior to final field tests. This strategy was established in order to reduce
the number of clones to be tested in the field. Six Phage -displayed random
peptide libraries were selected with seven different strategies against the purified
hyperimmune serum of chickens (IgY) that were immunized with total proteins of
larvae and adults of Rhipicephalus (Boophilus) microplus. The selected Phage
clones were sequenced, translated and analyzed through bioinformatics. To
evaluate the potential of these phagotopes as effective candidate vaccines, ELISA
assays, dot-blot, mice immunization (MI), humoral immune response (HIR) of
cattle against the clones and a cutaneous hypersensitivity tests in cattle were
performed. The selected Phage clones were analyzed through bioinformatics,
generating 107 different peptides in a total of 281 sequences. Some selected
phagotopes showed excellent matches with linear sequences of known proteins of
the Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Peptides that did not present significant
matches with known proteins, but shared extensive homology among each other,
were clustered and classified as conformational epitopes of Rhipicephalus
(Boophilus) microplus, or considered as mimotopes of unknown proteic antigens.
Among all clones tested by dot-blots, the 40 most reactive ones were further
screened by HIR and MI. The mice sera raised against the Phage clones clearly
recognized tick proteins indicating that the phagotope-induced immune responses
were antigen-specific, but not all could be identified by the sera of naturally infested cattle (Bos taurus and Bos indicus). Four clones were then selected to go
through the cutaneous hypersensitivity tests, and apparently all of them were
effectives at diferent degrees. The stringent selection processes coupled with this
schemes of validation assays allowed us to narrow down the number of peptides
that should be tested in the field. One of the advantages of using whole
recombinant M13 virus, carrying the recombinant peptide in fusion with the pIII
protein of the virus, is that its capsid acts as adjuvant and could be tested directly
without any further mixture. Additionally, we have finally used anergy skin tests
(cutaneous hypersensitivity tests) once they are sometimes used to guide clinical
decisions. We have assumed that cutaneous hypersensitivity tests measure a
common property of cellular immune function relevant to the outcome, which
together with the humoral response in naturally infested animals may provide us
with sequences of peptides that may be relevant as vaccines. Finally, we have
used those sequences to produce multiple antigen peptide system (MAPS), which
will be used in future field tests. The present work demonstrates that the whole
epitope profile can obtained through screening the Phage Displayed peptide
libraries with the hyperimmune serum and reveals the potential of using epitopedisplaying
Phage s as peptide vaccines against ticks. / Os carrapatos tem provocado significativas perdas econômicas na
produção animal mundial na ordem de bilhões de dólares anuais. Embora vários
antígenos específicos tenham sido empregados em testes vacinais, nenhum tem
propiciado controle eficaz, sendo necessária a identificação de novos antígenos,
bem como de novas estratégias vacinais. A tecnologia de Phage Display tem sido
amplamente empregada no mapeamento de estruturas antigênicas as quais tem
servido como base para o desenvolvimento de vacinas moleculares e representa
uma alternativa as metodologias tradicionais. No presente trabalho, utilizou-se a
tecnologia para o mapeamento de epítopos do Rhipicephalus (Boophilus)
microplus e, para validar os peptídeos selecionados como potencial imunógenos,
foi adotado um processo com múltiplas etapas de caracterização dos clones
previamente aos ensaios clínicos. Esta estratégia foi estabelecida com o objetivo
de reduzir o número de clones a ser testados em bovinos como imunógenos
candidatos. Foram utilizadas para a seleção seis bibliotecas distintas de
peptídeos randômicos expressados em bacteriófagos filamentosos e sete
estratégias de seleção contra as imunoglobulinas (IgY) purificadas de soro
hiperimune de galinhas imunizadas com proteínas totais de larvas e adultos de
Rhipicephalus (Boophilus) microplus. As seqüências do DNA correspondente aos
insertos dos fagos selecionados foram seqüenciados, traduzidos e analisados por
análises in silico. Foram realizados testes de ELISA, Dot-Blot, imunização em
camundongos, determinação da resposta imune humoral de bovinos naturalmente
infestados, e a medição da hipersensibilidade cutânea com o objetivo de evoluir o
potencial destes fagotopos como candidatos efetivos a novos imunógenos. Foram
gerados 107 peptídeos distintos em um total de 281 seqüências, sendo alguns
destes similares às seqüências protéicas lineares do Rhipicephalus (Boophilus)
microplus. Os peptídeos sem similaridades significativas com proteínas
conhecidas, mas que apresentaram seqüências consenso entre os peptídeos
obtidos, foram agrupados e classificados como epítopos conformacionais ou
considerados como mimetopos de antígenos protéicos desconhecidos do
Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Entre os clones testados por Dot-Blot, os 40
mais reativos foram posteriormente testados em ensaios de imunização em camundongos e também submetidos ao reconhecimento humoral de bovinos
naturalmente infestados com carrapatos. Adicionalmente, utilizou-se o teste
cutâneo de hipersensibilidade para a análise da imunidade celular. Os soros de
camundongos imunizados com os clones de fagos foram reativos as proteínas de
carrapato indicando que os fagotopos foram capazes de gerar resposta imune
antígeno específica, embora nem todos os fagos fossem reconhecidos pelo soro
de animais naturalmente infestados (Bos taurus e Bos indicus). Após a
caracterização e validação, quatro fagotopos foram escolhidos para a realização
dos testes cutâneos, os quais apresentaram graus variados de reatividade. Uma
das vantagens da utilização do vírus M13 recombinante, contendo o peptídeo
recombinante fusionado na proteína PIII do vírus, é que o próprio capsídio atua
como adjuvante e pode ser testado diretamente após a seleção sem
procedimentos adicionais de preparo do antígeno. Finalmente, as seqüências
determinadas foram utilizadas para a produção e expressão de um sistema
recombinante de múltiplos antígenos peptídicos (MAPS). Foram escolhidos 10
peptideos para a expressão na forma de multi-epitopos, os quais serão
futuramente utilizados em ensaios clínicos. O presente trabalho demonstrou que
um perfil geral dos epítopos pode ser obtido através da utilização de bibliotecas
de peptídeos randômicos expressados em bacteriófagos filamentosos contra
anticorpos obtidos de soro hiperimune e revela o potencial da seleção e utilização
peptídeos epítopos específicos como potenciais vacinas recombinantes multiantigênicas
para o controle do carrapato bovino. / Doutor em Genética e Bioquímica
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/urn:repox.ist.utl.pt:RI_UFU:oai:repositorio.ufu.br:123456789/15704 |
| Date | 27 May 2008 |
| Creators | Prudencio, Carlos Roberto |
| Contributors | Goulart Filho, Luiz Ricardo, Beletti, Marcelo Emílio, Szabó, Matias Pablo Juan, Vaz Junior, Itabajara da Silva, Azevedo, Vasco Ariston de Carvalho |
| Publisher | Universidade Federal de Uberlândia, Programa de Pós-graduação em Genética e Bioquímica, UFU, BR, Ciências Biológicas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFU, instname:Universidade Federal de Uberlândia, instacron:UFU |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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