Titre de l'écran-titre (visionné le 9 avril 2024) / Les myopathies liées à *RYR1*, les myopathies congénitales les plus fréquemment diagnostiquées, se caractérisent par une hypotonie musculaire squelettique et une faiblesse musculaire squelettique non progressive ou lentement progressive. Les myopathies liées à *RYR1* sont causées par des mutations dans le gène *RYR1*. L'édition Prime a le potentiel d'atteindre une efficacité élevée dans le traitement des myopathies liées à *RYR1* en ciblant les mécanismes physiopathologiques en amont. L'édition Prime utilise le même mécanisme que les systèmes CRISPR/Cas conventionnels, permettant toutes les conversions possibles de base à base et leurs combinaisons, mais n'exploite pas de modèle d'ADN double brin (dADN) ni ne confère de cassures double-brin (DSB) dans la séquence cible. La correction de la mutation T4709M est un exemple important pour le traitement potentiel des maladies liées à *RYR1*. Le maintien d'une homéostasie calcique adéquate pourrait réduire l'incidence de la faiblesse musculaire, améliorer la contraction musculaire et renforcer la fonction motrice globale. La correction des mutations du gène *RYR1* en utilisant l'édition Prime offre également la possibilité de prévenir l'apparition de complications associées aux maladies liées à *RYR1*. La correction précoce de la mutation T4709M pourrait améliorer le pronostic à long terme des personnes atteintes en fonction de l'évolution observée de la faiblesse musculaire et de l'incapacité. Cette approche offre la possibilité d'établir des schémas thérapeutiques plus efficaces et individualisés afin d'optimiser les avantages thérapeutiques et de minimiser simultanément les effets indésirables. Ainsi, cette étude vise à explorer l'application de l'édition Prime pour le traitement des myopathies liées à *RYR1*. Les myopathies liées à *RYR1* sont causées par des mutations dans le gène *RYR1*. L'efficacité de l'édition Prime dans la correction de T4709M, une mutation faux-sens de *RYR1*, a été évaluée à la fois *in vitro* et *in vivo*. Pour les expériences *in vitro*, les plasmides d'édition Prime ont été transfecté dans des cellules HEK293T, des cellules primaires de fibroblastes humains, une lignée de cellules de myoblastes humains, des cellules primaires de fibroblastes *RYR1ᵀᴹ/ᵀᴹ* de souris et des cellules C2C12 par électroporation. Pour les expériences *in vivo*, les plasmides d'édition Prime ont été injectés dans le modèle de souris *RYR1ᵀᴹ/ᵀᴹ*, suivi d'une électroporation. Plusieurs pegARN ont été testés. Les résultats des expériences *in vitro* montrent que l'efficacité de correction varie selon les pegARN. PE3 est l'un des dispositifs incrémentiels de l'édition Prime. PE3b est une version ajustée de PE3 avec une efficacité de correction améliorée et une gamme étendue de modifications génétiques ciblées. La stratégie PE3 s'est révélée plus efficace que la stratégie PE3b pour corriger la mutation ponctuelle. L'efficacité de correction de l'édition Prime peut être améliorée en effectuant plusieurs transfections ou en ajoutant une séquence ARN formant des doubles brins (appelée TevopreQ1) au pegARN. L'efficacité de correction de la mutation *RYR1* T4706M par l'édition Prime *in vivo* ne peut être confirmée. / *RYR1*-related myopathies, the most frequently diagnosed congenital myopathies, are characterized by skeletal muscle hypotonia and non-progressive or slowly progressive skeletal muscle weakness. *RYR1*-related myopathies are caused by mutations in the *RYR1* gene. Prime editing has the potential to achieve a high efficiency in the treatment of *RYR1*-related myopathies by targeting the upstream of the pathophysiological mechanisms. Prime editing employs the same mechanism as conventional CRISPR/Cas systems mediating all 12 possible base-to-base conversions and combinations but does not exploit a dDNA template or confer DSBs in the target sequence. Correction of the T4709M mutation is important example for the potential treatment of *RYR1*-related diseases. Maintenance of proper calcium homeostasis could ameliorate muscle weakness, improve muscle contractility, and enhance overall motor function. Correcting mutations of the *RYR1* gene using Prime editing also offers the potential to prevent the occurrence of complications associated with *RYR1*-related diseases. Early correction of the T4709M mutation may improve the long-term prognosis for affected individuals based on observed progression of muscle weakness and disability. This approach offers the potential for establish more effective and individualized treatment regimens to optimize therapeutic benefits and to simultaneously minimize adverse effects. Thus, this study aims to explore the application of Prime editing for treating *RYR1*-related myopathies. *RYR1*-related myopathies are caused by mutations in the *RYR1* gene. The efficiency of Prime editing in correcting T4709M, a missense mutation of *RYR1*, was evaluated both *in vitro* and *in vivo*. For *in vitro* experiments, the Prime editing plasmids were transfected into HEK293T cells, human fibroblast primary cells, human myoblast cell line, mouse *RYR1ᵀᴹ/ᵀᴹ* fibroblast primary cells, and C2C12 cells through electroporation. For *in vivo* experiments, the Prime editing plasmids were injected into *RYR1ᵀᴹ/ᵀᴹ* mouse model followed by electroporation. Multiple pegRNAs were tested. The results of *in vitro* experiments show that correction efficiency varies across pegRNAs. PE3 is one of the incremental devices in Prime editing. PE3b is an adjusted version of PE3 with improved editing efficiency and expanded range of targeted genetic modifications. The PE3 strategy was found to be a more effective than PE3b strategy for correcting the point mutation. The correction efficiency of Prime editing can be improved by conducting multiple transfections or by adding a RNA sequence forming double strands (called TevopreQ1) to pegRNA. The efficiency of correcting *RYR1* T4706M mutation by Prime editing *in vivo* cannot be confirmed.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/141824 |
| Date | 12 April 2024 |
| Creators | Song, Bo |
| Contributors | Tremblay, Jacques-P. |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | COAR1_1::Texte::Thèse::Mémoire de maîtrise |
| Format | 1 ressource en ligne (x, 44 pages), application/pdf |
| Rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
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