La protéine Haspine est une sérine / thréonine kinase mitotique conservée, connue pour fonctionner par la phosphorylation de l'histone H3 (H3pT3). Bien que H3T3 soit le seul substrat bien connu de Haspine, il se peut que H3pT3 ne suffise pas à expliquer toutes les fonctions de Haspine au cours de la mitose. Fait intéressant, l’homologie de la portion N-terminale de H3 avec la portion Cterminale de H2B suggère que la thréonine 119 de H2B (H2BT119) est un candidat potentiel fort pour être un substrat majeur de Haspine. Ainsi, l’objectif de ce projet était d’étudier la phosphorylation de H2BT119 dépendante de Haspine pendant la mitose. La phosphorylation de H2B recombinant sur la position T119 par Haspine a été confirmée par un dosage de kinase en utilisant la radioactivité. En outre, le signal H2BpT119 sur la protéine recombinante H2B a été détecté par un anticorps anti-H2BpT119, confirmant la phosphorylation de H2B dépendante de Haspine sur ce site dans le test de kinase in vitro. En outre, une augmentation de la taille moléculaire de H2B a été observée après le dosage de la kinase. Les résultats des expériences in vivo, incluant l'analyse par Western-blot d'extrait d'histones mitotiques et la microscopie à fluorescence avec l'anti-H2BpT119, suggèrent une phosphorylation de H2B au site T119, qui s'est également avérée dépendant de l'activité de Haspine. Cependant, en raison de la potentielle réactivité croisée de l’anti-H2BpT119 avec H3pT3, une forme marquée de H2B a été utilisée lors de l’étude du signal H2BpT119 au cours de la mitose. Le marquage augmente la taille moléculaire de H2B et aide à reconnaître H2BpT119 loin de H3pT3. Plusieurs systèmes de marquage ont été utilisés, mais toutes les tentatives ont échoué, en raison du faible niveau de H2B exogène. Cependant, les résultats de ce projet suggèrent que le signal H2BpT119 pendant la mitose pourrait révéler un nouveau mécanisme dépendant de Haspine pour la régulation de la ségrégation des chromosomes. Par conséquent, il reste important d'étudier cette marque d'histone au cours de la mitose. / Haspin is a conserved mitotic serine/threonine kinase that is known to function through histone H3 phosphorylation (H3pT3). Despite this, H3T3 is the only well-known substrate for Haspin, H3pT3 may not be enough to explain all Haspin functions during mitosis. Interestingly, homology of H3 N-terminus with H2B C-terminus suggests that H2BT119 is a strong potential candidate to be a major substrate of Haspin. Thus, the aim was to investigate Haspin-dependent phosphorylation of H2BT119 during mitosis. Phosphorylation of recombinant H2B at T119 by Haspin was confirmed by a radioactivity-based kinase assay. Also, H2BpT119 signal on recombinant H2B was detected by an anti-H2BpT119 antibody, confirming Haspin-dependent phosphorylation of H2B at this site in the in vitro kinase assay. Also, an upshift of H2B was observed following the kinase assay. Results from in vivo experiments, including Western blot analysis of mitotic histone extract and immunofluorescence microscopy with the anti-H2BpT119, support phosphorylation of T119 in H2B, which also was found to depend on Haspin activity. However, due to the potential anti-H2BpT119 cross-reactivity with H3pT3, while exploring H2BpT119 signal during mitosis, tagged H2B was used. The tag increases H2B molecular size and helps to distinguish H2BpT119 from H3pT3. Several tagging systems was used, but all attempts failed, because of the low level of the exogenous tagged H2B. However, the results of this project suggest H2BpT119 signal during mitosis that may reveal a novel Haspindependent mechanism for chromosome segregation regulation. Therefore, it remains important to study this histone mark during mitosis.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/66558 |
| Date | 07 December 2020 |
| Creators | Alharbi, Ibrahim |
| Contributors | Chandad, Fatiha |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | thèse de doctorat, COAR1_1::Texte::Thèse::Thèse de doctorat |
| Format | 1 ressource en ligne (xiii, 115 pages), application/pdf |
| Rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
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