La livraison d’acides nucléiques a révolutionné la recherche biomédicale depuis des décennies. Il existe de nombreuses manières de livrer des acides nucléiques dans des cellules de mammifères. Chaque méthode possède ses avantages et ses inconvénients. Parmi elles, celles dites hybrides, représentent une alternative très intéressante puisqu’elles résultent de la combinaison de méthodes de livraison traditionnelles pour en obtenir une nouvelle aux propriétés améliorées. Cette thèse se consacre à l’étude d’une de ces méthodes de livraison hybride appelée gésifection. Cette dernière consiste à combiner des nanovésicules biologiques appelées « gésicules » avec un agent chimique nommé bromure d’hexadiméthrine pour livrer des acides nucléiques dans des cellules de mammifères. Bien que cette méthode ait fait l’objet de peu de recherches, les résultats publiés jusqu’à présent apparaissent suffisamment intéressants pour poursuivre son développement et sa caractérisation. Cette thèse est divisée en quatre chapitres. Le chapitre 1, est dédié à la revue de la littérature. Il présente un tour d’horizon des méthodes de livraison d’acides nucléiques, puis une présentation des mécanismes impliqués dans la pénétration cellulaire, et enfin, un état des lieux concernant les travaux sur les gésicules. Les chapitres 2, 3 et 4, présentent les travaux expérimentaux réalisés dans le cadre de cette thèse. Le chapitre 2 est consacré au développement d’une méthode optimisée pour produire et utiliser les gésicules pour la livraison d’acides nucléiques. Les gésicules se sont révélées être des particules très résistantes puisque leur capacité de livraison a été maintenue après plusieurs semaines de conservation à différentes températures, ainsi qu’après plusieurs cycles de congélation décongélation. Par ailleurs, les expériences de gésifection ont démontré la capacité de cette méthode à livrer de l’ADN dans des cellules primaires (connues pour être réfractaires) mais également des acides ribonucléiques (ARN) et des plasmides de grandes tailles. Le chapitre 3 est consacré à des expériences de caractérisation des gésicules au niveau morphologique et de leur contenu protéique. Les gésicules ont été visualisées par microscopie électronique avec la confirmation de la présence de la protéine VSV-G à leur membrane. Enfin, une analyse par spectrométrie de masse a permis de fournir la première description du contenu protéique des gésicules. Cela a permis de faire apparaître toute la complexité de ces nanovésicules. Le dernier chapitre de cette thèse (chapitre 4) est dédié à l’identification des mécanismes de pénétration et de transport cellulaire impliqués dans la gésifection. Tout d’abord, une série d’expériences préliminaires a permis d’établir des conditions expérimentales garantissant la fiabilité des résultats (efficacité des lavages, efficacité et innocuité des inhibiteurs métaboliques). Les résultats ont démontré que les complexes de gésifection pénètrent dans les cellules HeLa par macropinocytose et endocytose dépendante des clathrines. Leur parcours intracellulaire jusqu’au noyau de la cellule implique quant à lui, les dynéines et les microtubules. En conclusion, cette thèse contribue significativement au développement de la méthode de gésifection en décrivant un procédé de production et d’utilisation efficaces, et en apportant une meilleure compréhension de la composition et du fonctionnement des gésicules pour livrer des acides nucléiques. / The delivery of nucleic acids has revolutionized the biomedical field for decades, for research as well as for therapeutic applications. There are many nucleic acids delivery methods for mammalian cells. Each has its advantages and disadvantages. Hybrid methods represent a very interesting alternative for the delivery of nucleic acids since it consists in combining elements of existing vectors to develop more efficient new ones. This thesis is devoted to the study of one of these hybrid delivery methods called gesifection. Gesifection involves virus-like particles, pseudotyped with the VSV glycoprotein, able to deliver nucleic acids when combined with a chemical agent named polybrene. Even though the gesifection’s efficiency has been stated in only a few publications, the results were interesting enough for us to investigate the depth of its potential. This thesis is divided into 4 main parts. The chapter 1 is dedicated to a review of the literature and presents the main methods of nucleic acid delivery, followed by a presentation of the mechanisms involved in cell penetration and finally, an inventory of the gesicles and their uses. The chapter 2 of this thesis presents the work that allowed us to optimize the production of gesicles, to determine the best way to use them, to demonstrate their great robustness as well as their capacity to transfect primary cells, large plasmids and also interfering RNAs. The chapter 3 is dedicated to the characterization of gesicles. We have highlighted the formation of gesifection complexes, successfully carried out the purification of gesicles efficient for nucleic acid delivery, visualized the gesicles with their membrane composed of VSV-G proteins and finally, provides the first description of their protein content, showing all the complexity of these particles. Finally, the chapter 4 studies the mechanisms of penetration and cell transport involved during the gesifection. Our results revealed for the first time, that the gesifection complexes enter in HeLa cells by macropinocytosis and clathrin-dependent endocytosis. Furthermore, their intracellular course involves dyneins and microtubules. All of the results presented in this thesis provide a better understanding of gesifection for future developments.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/67903 |
| Date | 11 February 2021 |
| Creators | Mangion, Mathias |
| Contributors | Gaillet, Bruno |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | thèse de doctorat, COAR1_1::Texte::Thèse::Thèse de doctorat |
| Format | 1 ressource en ligne (xvii, 229 pages), application/pdf |
| Rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
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