Th.--Sci. nat.--Paris 11--Orsay, 1977. N°: 1914.

Durant la grossesse, 30 g de calcium de la mère vers le foetus sont transférés à travers le placenta à raison de 140 mg/Kg/jour pendant le troisième trimestre. Cet apport calcique est primordial au bon développement du foetus notamment dans la formation de ses os et ses dents. De plus, le calcium passant au travers du placenta provient à la fois de la diète maternelle et de la résorption des os maternels afin de subvenir convenablement aux besoins foetaux. Il est donc essentiel que la consommation de calcium par la mère soit suffisante, qu'il y ait une bonne efficacité du transport transplacentaire et que le foetus présente une bonne aptitude à fixer cet ion. Il existe des protéines permettant le transport de calcium comme les canaux TRPV faisant passer le calcium de la circulation maternelle vers le cytoplasme des syncytiotrophoblastes, les CaBPs responsables du transport de calcium dans le cytoplasme, ainsi que la pompe PMCA assurant le transfert du calcium des syncytiotrophoblastes vers la circulation foetale contre le gradient de calcium, aidées potentiellement par l'échangeur Na+/Ca2+. Le but de cette étude est de caractériser la régulation de l'expression de ces protéines responsables du transfert calcique dans le placenta en fonction de la présence ou non de l'action des hormones PTH et PTHrP via le récepteur PTH1R. En effet, ces deux hormones favoriseraient l'expression des protéines à caractère calcium en se liant au récepteur PTH1R. La lignée de cellules de carcinome humain (JEG-3) est traitée ou non avec l'antagoniste aux deux récepteurs PTH (7-34). Les cellules sont traitées pendant 4 jours, et les ARNm sont extraits après 2 et 4 jours de traitement. L'expression des différentes protéines à calcium est quantifiée par PCR en temps réel. On s'attendrait à une diminution de l'expression de celles-ci en absence de signalisation via le récepteur PTH1R puisque PTHrP est un facteur connu pour maintenir le gradient calcique allant de la circulation maternelle à foetale, et que sa concentration dans la circulation augmente fortement au moment où le transport de calcium est à son maximum; et la PTH est également connu pour être un facteur hypercalcémiant. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Placenta, Calcium, Transport, PTH, PTHrP, PTH1R.

L'absorption intestinale de Cd, un métal toxique auquel la population générale est exposée par l'alimentation, a été largement étudiée mais aucune étude n'a considéré l'épithélium intestinal comme organe excréteur de Cd. Lors d'intoxications chroniques, le Cd circulant dans le sang pourrait être transporté à l'intérieur de l'entérocyte du côté basolatéral (BL). L'excrétion du Cd pourrait se faire par efflux du côté apical (AP) de l'entérocyte ou par accumulation du Cd dans l'entérocyte jusqu'à sa mort par apoptose lors du renouvellement de l'épithélium intestinal. L'objectif de notre étude a été de caractériser le transport de Cd du côté BL vers le côté AP en utilisant comme modèle in vitro les cellules TC7 cultivées sur filtres, un clone hautement différencié de la lignée enterocytaire humaine Caco-2. Les hypothèses suivantes ont été testées: 1) un transporteur de cations organiques (OCT1) pourrait transporter le Cd du côté BL; 2) un système de type MDR ou MRP pourrait être impliqué dans l'efflux AP de Cd. Nos résultats démontrent une stimulation de l'accumulation BL à pH 8,5 en milieu chlorure mais pas en milieu nitrate suggérant une implication d'OCT1 dans le transport des CdCIn²¯ⁿ mais pas du Cd²⁺. La cimetidine, un inhibiteur d'OCT1, a diminué de 37 % le transport de ¹⁰⁹Cd après 1h d'exposition à 0,5 µM de traceur. L'efflux AP de 30 min était inhibé de 19 % en présence d'inhibiteurs de MDR1 et MRP2, soient le vérapamil et le probenecid. Nos résultats suggèrent qu'OCT1 à la membrane BL ainsi que MDR1 et MRP2 à la membrane AP sont impliqués dans le transport de Cd dans les cellules TC7. De plus, la présence de Cd non radioactif dans le milieu d'efflux a stimulé l'efflux AP de ¹⁰⁹Cd. Ces résultats suggèrent l'implication d'un mécanisme de contre-échange différent de MDR1 et MRP2 qui sont strictement des mécanismes d'efflux. Notre étude a donc démontré que l'épithélium intestinal, tout comme le foie et les reins, pourrait jouer un rôle dans l'excrétion de Cd lors d'intoxications chroniques. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Transport membranaire, Cd, OCT1, MRP2, MDR1, Basolatéral, Épithélium intestinal, Caco-2.

L'exposition au cadmium (Cd) représente un facteur de risque pour la perte osseuse et le développement de l'ostéoporose. Jusqu'à récemment, les études portaient principalement sur les effets toxiques indirects du Cd sur l'os via un dysfonctionnement rénal et une perturbation du métabolisme du calcium (Ca). Des données récentes révèlent toutefois qu'une faible exposition chronique au Cd sans effet néphrotoxique entraîne des dommages directs aux os. Le premier objectif de cette étude visait à évaluer dans quelle mesure le Cd est accumulé dans les ostéoblastes et à déterminer sa cytotoxicité. Pour ce faire, nous avons mesuré l'accumulation cellulaire de 109Cd ainsi que la viabilité cellulaire par l'essai MTT. De plus afin de tenter d'identifier les voies d'entrée cellulaire du Cd, nous avons utilisé certains bloqueurs (nifédipine, vérapamil, 2-APB, SKF26365 et capsazépine) et activateurs (Bay-K8644, icilin et thapsigargine) de canaux. Le second objectif était de mieux comprendre comment la cellule ostéoblastique se protège contre les effets toxiques du Cd. Pour y répondre, nous avons étudié l'expression de certains gènes reconnus pour être impliqués dans la protection cellulaire par une technique de RT-PCR. Après avoir exposé les cellules MG-63 au Cd pendant 24h, nous avons obtenu une valeur de CL50 de 15,5 ± 1,1 µM. Nos résultats ont également montré la présence de transport spécifique permettant l'entrée de Cd dans les ostéoblastes MG-63. La spéciation du Cd est déterminante pour son entrée. Nous avons observé une accumulation cellulaire sous forme de Cd2+ et possiblement sous forme de CdCln*2-n. L'observation d'une inhibition de l'entrée de Cd par le Ca nous a mené à étudier les canaux calciques comme voies d'entrée du Cd. Afin de déterminer si les canaux calciques voltage-dépendants (VDCC) constituent une voie d'entrée du Cd dans les ostéoblastes humains, les cellules MG-63 ont été exposées à 0,5 µM 109Cd durant 3 minutes dans différents milieux inorganiques. Le milieu nitrate (dans lequel 80% du Cd total dissous est présent sous forme de Cd2+) favorise l'entrée de Cd par rapport au milieu chlorure (dans lequel 14% du Cd total dissous est présent sous forme de Cd2+), suggérant que le Cd peut pénétrer la cellule sous forme Cd2+. Lorsque la concentration en potassium (K) du milieu d'exposition est augmentée afin d'activer les VDCC, aucune augmentation de l'entrée de Cd n'est observée. L'utilisation de nifédipine et de vérapamil, deux bloqueurs de VDCC, n'a aucun effet sur l'entrée du Cd. Nos résultats n'indiquent donc aucune implication des VDCC dans l'entrée de Cd dans les ostéoblastes MG-63. Les résultats de transport membranaires concordent avec les essais MTT qui montrent l'absence d'effet de la nifédipine, du vérapamil et du Bay-K8644 sur la cytotoxicité du Cd. Les canaux TRPC ne semblent pas non plus être impliqués dans l'entrée de Cd tel que démontré par l'absence d'effet de la thapsigargine sur le transport de Cd utilisée seule ou combinée au SKF96365. Aussi, le SKF96365 ne semble pas modifier les résultats de MTT. L'effet protecteur du 2APB et de la capsazépine observé lors d'essais MTT suggère la participation respective des canaux TRPM7 et TRPM8 dans l'entrée de Cd. De plus, nous avons observé une différence dans la cytotoxicité du Cd (CL50 variant jusqu'à 3 fois) dans les lignées ostéoblastiques humaines MG-63, SaOS-2 et U2OS (respectivement 16 ± 2,30 ± 6 et 55 ± 4 µM). Nos résultats n'indiquent aucune différence dans les niveaux d'accumulation de Cd entre les trois lignées. Nous proposons donc l'hypothèse voulant qu'il existe des différences au niveau des mécanismes de gestion du Cd intracellulaire. Nos résultats préliminaires obtenus par RT-PCR montrent que chacune des lignées expriment les ARNm de MTs et de HSP70. Il est donc possible que l'induction de MTs et de HSP70 diffère entre les lignées cellulaires. En conclusion, le Cd entre dans les ostéoblastes MG-63 de façon spécifique en empruntant une ou des voies calciques, dont possiblement les canaux TRPM7 et TRPM8. Il est possible que la cytotoxicité qui s'en suit contribue aux déséquilibres oméostatiques observés aux niveaux des os. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : cadmium, calcium, spéciation, ostéoblastes, os, cellules MG-63, cellules SaOS-2, cellules U2OS

Proefschrift--Universiteit Leiden, 2003. / PK = Pharmacokinetics, PD = pharmacodynamics. Notes bibliogr.

La livraison d’acides nucléiques a révolutionné la recherche biomédicale depuis des décennies. Il existe de nombreuses manières de livrer des acides nucléiques dans des cellules de mammifères. Chaque méthode possède ses avantages et ses inconvénients. Parmi elles, celles dites hybrides, représentent une alternative très intéressante puisqu’elles résultent de la combinaison de méthodes de livraison traditionnelles pour en obtenir une nouvelle aux propriétés améliorées. Cette thèse se consacre à l’étude d’une de ces méthodes de livraison hybride appelée gésifection. Cette dernière consiste à combiner des nanovésicules biologiques appelées « gésicules » avec un agent chimique nommé bromure d’hexadiméthrine pour livrer des acides nucléiques dans des cellules de mammifères. Bien que cette méthode ait fait l’objet de peu de recherches, les résultats publiés jusqu’à présent apparaissent suffisamment intéressants pour poursuivre son développement et sa caractérisation. Cette thèse est divisée en quatre chapitres. Le chapitre 1, est dédié à la revue de la littérature. Il présente un tour d’horizon des méthodes de livraison d’acides nucléiques, puis une présentation des mécanismes impliqués dans la pénétration cellulaire, et enfin, un état des lieux concernant les travaux sur les gésicules. Les chapitres 2, 3 et 4, présentent les travaux expérimentaux réalisés dans le cadre de cette thèse. Le chapitre 2 est consacré au développement d’une méthode optimisée pour produire et utiliser les gésicules pour la livraison d’acides nucléiques. Les gésicules se sont révélées être des particules très résistantes puisque leur capacité de livraison a été maintenue après plusieurs semaines de conservation à différentes températures, ainsi qu’après plusieurs cycles de congélation décongélation. Par ailleurs, les expériences de gésifection ont démontré la capacité de cette méthode à livrer de l’ADN dans des cellules primaires (connues pour être réfractaires) mais également des acides ribonucléiques (ARN) et des plasmides de grandes tailles. Le chapitre 3 est consacré à des expériences de caractérisation des gésicules au niveau morphologique et de leur contenu protéique. Les gésicules ont été visualisées par microscopie électronique avec la confirmation de la présence de la protéine VSV-G à leur membrane. Enfin, une analyse par spectrométrie de masse a permis de fournir la première description du contenu protéique des gésicules. Cela a permis de faire apparaître toute la complexité de ces nanovésicules. Le dernier chapitre de cette thèse (chapitre 4) est dédié à l’identification des mécanismes de pénétration et de transport cellulaire impliqués dans la gésifection. Tout d’abord, une série d’expériences préliminaires a permis d’établir des conditions expérimentales garantissant la fiabilité des résultats (efficacité des lavages, efficacité et innocuité des inhibiteurs métaboliques). Les résultats ont démontré que les complexes de gésifection pénètrent dans les cellules HeLa par macropinocytose et endocytose dépendante des clathrines. Leur parcours intracellulaire jusqu’au noyau de la cellule implique quant à lui, les dynéines et les microtubules. En conclusion, cette thèse contribue significativement au développement de la méthode de gésifection en décrivant un procédé de production et d’utilisation efficaces, et en apportant une meilleure compréhension de la composition et du fonctionnement des gésicules pour livrer des acides nucléiques. / The delivery of nucleic acids has revolutionized the biomedical field for decades, for research as well as for therapeutic applications. There are many nucleic acids delivery methods for mammalian cells. Each has its advantages and disadvantages. Hybrid methods represent a very interesting alternative for the delivery of nucleic acids since it consists in combining elements of existing vectors to develop more efficient new ones. This thesis is devoted to the study of one of these hybrid delivery methods called gesifection. Gesifection involves virus-like particles, pseudotyped with the VSV glycoprotein, able to deliver nucleic acids when combined with a chemical agent named polybrene. Even though the gesifection’s efficiency has been stated in only a few publications, the results were interesting enough for us to investigate the depth of its potential. This thesis is divided into 4 main parts. The chapter 1 is dedicated to a review of the literature and presents the main methods of nucleic acid delivery, followed by a presentation of the mechanisms involved in cell penetration and finally, an inventory of the gesicles and their uses. The chapter 2 of this thesis presents the work that allowed us to optimize the production of gesicles, to determine the best way to use them, to demonstrate their great robustness as well as their capacity to transfect primary cells, large plasmids and also interfering RNAs. The chapter 3 is dedicated to the characterization of gesicles. We have highlighted the formation of gesifection complexes, successfully carried out the purification of gesicles efficient for nucleic acid delivery, visualized the gesicles with their membrane composed of VSV-G proteins and finally, provides the first description of their protein content, showing all the complexity of these particles. Finally, the chapter 4 studies the mechanisms of penetration and cell transport involved during the gesifection. Our results revealed for the first time, that the gesifection complexes enter in HeLa cells by macropinocytosis and clathrin-dependent endocytosis. Furthermore, their intracellular course involves dyneins and microtubules. All of the results presented in this thesis provide a better understanding of gesifection for future developments.

La prévalence accrue de surplus pondéral et d'obésité chez les femmes en âge de procréer est un problème de santé publique. De nombreuses études ont démontré qu'un poids maternel trop faible ou trop élevé peut influencer le poids du nouveau-né et ainsi influencer son état de santé actuelle et future. Durant la grossesse, l'accumulation de gras foetal survient au dernier tiers. La disponibilité des acides gras essentiels pour le foetus ne dépend pas seulement de l'apport maternel en acide gras mais aussi de la fonction placentaire elle-même ainsi que des changements et des adaptations physiologiques et biochimiques qui surviennent durant la grossesse. Afin de vérifier l'influence d'un poids maternel hors norme sur ces facteurs de disponibilité des acides gras, l'isolation de cellules trophoblastiques a été effectuée à partir de placenta frais provenant de femmes ayant une masse corporelle au-dessous de la normale (IMC<20 kg/m²), de femmes ayant une masse corporelle normale (20 kg/m²<IMC<26 kg/m²) et de femmes obèses (BMI>30 kg/m²). Ces femmes faisaient partie d'une banque de femmes recrutées pour participer au Projet Lipides de notre laboratoire de physiologie materno-foetale. Des études de transport d'acide linoléique, un acide gras essentiel, ont ensuite été effectuées sur des syncytiotrophoblaste et des cytotrophoblastes isolées à partir des placentas des femmes recrutées pour le projet. Par la suite, ce transport d'acide linoléique a été mis en relation avec les dosages maternelles lipidiques et hormonaux des deuxième et troisième tiers ainsi qu'avec les dosages lipidiques et hormonaux foetaux à la naissance. Cette étude met en évidence une diminution du transport syncytiotrophoblastique de l'acide linoléique par la maigreur et l'obésité pré-grossesse maternelle. En fait, le transport de l'acide linoléique est davantage perturbé dans les syncytiotrophoblastes, que dans les cellules trophoblastiques précurseurs, les cytotrophoblastes. De plus, l'obésité (lMC>30) pré-grossesse a été corrélée à une augmentation des niveaux maternels d'insuline lors du deuxième et troisième tiers ainsi qu'à une diminution des concentrations de TSH et d'AFP. D'autre part, la maigreur (lMC<20) pré-grossesse diminue les niveaux d'AFP et de T3 du troisième tiers et du sang foetal à terme. Ces importantes altérations des niveaux hormonaux qui surviennent durant les grossesses de femmes obèses et de femmes maigres pourraient expliquer la diminution du transport placentaire de l'acide linoléique, un acide gras essentiel. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Grossesse, Placenta, Obésité, Indice de masse corporelle, Trophoblaste.

Le cadmium (Cd), métal extrêmement toxique, peut pénétrer dans l'organisme par ingestion, mais également par inhalation. Le mécanisme régissant son transport membranaire est jusqu'ici inconnu mais sa nature toxique suggère qu'il puisse emprunter des systèmes de transports dédiés à certains éléments essentiels tels que le calcium (Ca). Notre étude évalue la cytotoxicité du Cd, du Pb et du Hg utilisés seuls ou en combinaisons multiples dans deux lignées cellulaires humaines A549 et H441 qui représentent respectivement le phénotype de cellules alvéolaires et bronchiolaires de l'épithélium pulmonaire. La caractérisation du transport de Cd selon la spéciation organique et inorganique et selon le pH est aussi étudiée tout en vérifiant l'implication possible des voies calciques. L'essai MTT indique que le Cd et Hg sont cytotoxiques dans les deux lignées alors que le Pb ne semble pas affecter la viabilité cellulaire. Les résultats démontrent aussi que la lignée A549, pour laquelle la plus faible valeur de LC₅₀ a été mesurée, est deux fois plus sensible au Cd que la lignée H441 (60 µM vs 120 µM). L'étude de l'accumulation du ¹⁰⁹Cd montre que la variation de cette sensibilité ne peut être attribuée à une accumulation supérieure de Cd. Dans les deux lignées, les résultats de toxicité et d'accumulation du Cd en présence de Hg et de Pb indiquent la présence d'une corrélation entre les contenus cellulaires en Cd et le potentiel toxique. Il semble que le Pb protège les deux lignées contre la toxicité du Cd en inhibant le transport membranaire du Cd alors que le Hg sensibilise les cellules A549 en augmentant les niveaux d'accumulation du Cd. La caractérisation du transport membranaire de ¹⁰⁹Cd montre une inhibition de l'accumulation temporelle du ¹⁰⁹Cd dans un milieu chloré en présence d'un excès de Cd non radioactif ce qui indique l'implication d'un système spécifique de transport. Les paramètres d'accumulation et les caractéristiques cinétiques varient d'une lignée à l'autre et révèlent la présence d'un processus saturable et à haute affinité (Km < 5M dans les deux cas). L'accumulation de Cd est supérieure en milieux inorganiques (chloré et nitré) comparativement au milieu organique (DMEM) probablement suite à la complexation du Cd. Nos résultats montrent aussi une plus grande variation du transport de Cd en fonction du pH dans la lignée A549; le Cd étant bien moins transporté à pH acide. L'étude des interactions Cd-Ca montre que le Ca n'inhibe pas le transport du ¹⁰⁹Cd mais que le Cd inhibe le transport de ⁴⁵Ca. Dans les cellules A549, un transport de ⁴⁵Ca dépendant du voltage et hautement sensible à une inhibition par le Cd a aussi pu être mis en évidence. En conclusion, l'accumulation pulmonaire de Cd n'implique pas de voies de transport calciques et varie selon le phénotype cellulaire et les interactions avec d'autres métaux. La toxicité du Cd n'est pas toujours corrélée aux niveaux d'accumulation du métal et dépendrait d'autres mécanismes cellulaires qui réduisent la toxicité du Cd et diffèrent d'une lignée à l'autre. Nous émettons donc l'hypothèse que des mécanismes de protection cellulaire (GSH, MT et HSP70) seraient probablement responsables des variations de sensibilité observées dans les cellules A549 et H441. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Métaux lourds (Cd, Pb et Hg), Cellules A549 et H441, Transport membranaire, Viabilité cellulaire, Canaux calciques dépendants du voltage.

Lors de la grossesse, différentes complications peuvent survenir et amener des conséquences néfastes sur la santé de la mère et du foetus. Par exemple, une malformation du placenta peut mener à des conditions pathologiques telles le retard de croissance intra-utérin ou la pré-éclampsie. Ces maladies semblent, respectivement, être causées par un désordre lors de la différenciation des cytotrophoblastes en syncytiotrophoblastes et une altération du transport de calcium de la mère au foetus. Il est donc essentiel de découvrir les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régissent ces phénomènes afin de pouvoir, dans l'avenir, contrer le développement de telles conditions pathologiques. Chez la souris, le transport placentaire du calcium est dépendant du peptide apparenté à la parathormone (PTHrP) et son fragment N-terminal est impliqué dans le processus de différenciation des trophoblastes. Ainsi, cette étude a pour but premier de découvrir si la PTHrP (1-34) régule le transport calcique à travers les syncytiotrophoblastes humains. Par ailleurs, comme les Mitogen Activated Protein Kinases (MAPK) ERK1/2 et p38 sont impliquées dans le processus de différenciation des trophoblastes humains, cette étude vise aussi à déterminer si la PTHrP (1-34) peut stimuler la différenciation des trophoblastes humains via ces deux MAPKs. Il a tout d'abord été nécessaire de mettre au point un milieu de culture sans sérum pour observer les effets directs de l'hormone sur la différenciation cellulaire. Les cellules trophoblastiques sont isolées à partir de placentas humains frais et cultivées dans un milieu de culture sans sérum où la PTHrP est ajoutée en concentrations croissantes. Tout d'abord, la cytotoxicité cellulaire des différents traitements a été mesurée. La différenciation des cellules trophoblastiques est ensuite mesurée de manière biochimique par le dosage de l'hormone hCG et, de manière morphologique, par l'observation de la fusion cellulaire. L'activation des voies de signalisation de ERK1/2 et p38 est observée par irnmunobuvardage de type Western et par la capacité de l'hormone de réactiver la voie de signalisation suite à son blocage par un inhibiteur spécifique. La captation du calcium par les syncytiotrophoblastes est étudiée à l'aide de calcium radiomarqué (⁴⁵Ca²⁺) alors que l'effet de la PTHrP (1-34) sur les protéines impliquées dans le transport de l'ion calcique est étudié par PCR en temps réel et par immunobuvardage de type Western. Les résultats obtenus indiquent que les différents traitements administrés aux cellules trophoblastiques ne causent pas de mortalité cellulaire. Par la suite, nous avons constaté qu'une forte concentration de l'hormone stimule la différenciation des cellules cytotrophoblastiques en syncytiotrophoblastes. Ce processus de différenciation semble se faire par la MAPK ERK1/2 puisque cette dernière est davantage activée en présence de PTHrP (1-34). De plus, le fragment N-terminal de la PTHrP est capable de réactiver cette MAPK suite à son inhibition. Par la suite, il a été possible de constater que la présence du fragment N-terminal de la PTHrP dans le milieu de culture des cellules trophoblastiques permet une augmentation significative de l'expression des protéines PMCA1 et 4 au premier jour de culture. Ainsi, une perturbation de la concentration de PTHrP (1-34) pourrait être un phénomène impliqué dans des conditions pathologiques lors de la grossesse chez la femme enceinte. Éventuellement, il serait donc intéressant d'observer l'effet de cette hormone sur la différenciation et le transport calcique des trophoblastes chez des femmes atteintes de pré-éclampsie ou dont l'enfant souffre de retard de croissance intra-utérin. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Placenta, Trophoblaste, PTHrP, Différenciation, ERK1/2, p38, Calcium.

Depuis plusieurs années maintenant, les populations d'amphibiens sont en déclin, et ce, partout sur la planète. Le problème semble engendré par de multiples facteurs agissant de concert tels que le réchauffement climatique, l'augmentation des rayons ultraviolets, l'introduction d'espèces exotiques, l'augmentation des infections parasitaires et, probablement les deux plus importants, l'altération et la contamination de l'habitat. En ce qui concerne la pollution de l'habitat, la contamination d'origine agricole peut affecter grandement les amphibiens vivant à proximité de régions rurales. Avec l'avènement de l'agriculture intensive, sont en effet arrivés les nombreux pesticides que l'on retrouve maintenant dans plusieurs cours d'eau. Les contaminants d'origine agricole peuvent être la cause de nombreux problèmes de santé chez les amphibiens. Chez les grenouilles vivant à proximité de zones agricoles, des malformations sont souvent remarquées. Dès lors, une perturbation de l'homéostasie des rétinoïdes, des molécules notamment impliquées dans le développement embryonnaire, a été soupçonnée. Certaines études démontrent d'ailleurs une altération des concentrations hépatique et plasmatique de ces molécules chez des grenouilles provenant de régions fortement agricoles. Ainsi, l'objectif de la présente étude était de vérifier si les concentrations plasmatique et hépatique des rétinoïdes étaient affectés par l'agriculture chez les ouaouarons, Rana catesbeiana. Pour ce faire, des ouaouarons ont été échantillonnés au cours des étés 2007 et 2008 à différents sites du bassin versant de la rivière Yamaska sélectionnés selon un gradient d'intensité agricole. Les analyses des niveaux de rétinol hépatique, de rétinol plasmatique et d'esters de rétinol hépatiques ont toutes été réalisées en chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Les résultats démontrent une baisse du rétinol plasmatique au site de forte intensité agricole de la rivière Noire par rapport aux sites témoins pour les mâles échantillonnés en 2007 (p = 0,0006) et en 2008 (p = 0,01). Cependant, les concentrations des rétinoïdes hépatiques chez les mâles provenant de ce site ne sont pas différentes du site témoin de Deborah Stairs. Les différences ne sont cependant pas significatives chez les femelles qui présentent de plus grandes concentrations de rétinol plasmatique que les mâles (p = 0,001 pour les deux années regroupées). Chez les mâles, la baisse du rétinol plasmatique jumelée à une concentration normale de rétinoïdes hépatiques suggère une altération du transport du rétinol pour les ouaouarons provenant du site de la rivière Noire. Le transport du rétinol étant assuré par deux protéines, la RBP (protéine de liaison au rétinol) et la TTR (transthyrétine), nous avons tenté de mesurer les niveaux de ces deux protéines dans le sang avec une méthode de HPLC par exclusion de taille. Nous avons également essayé de mesurer les taux de synthèse hépatique de ces molécules en RT-PCR. Bien que ces deux tentatives se soient avérées non concluantes, cette étude a permis de réaliser d'importants progrès en ce qui concerne la mise au point de ces deux techniques. La RBP et la TTR sont deux molécules importantes pour de nombreuses fonctions physiologiques, c'est pourquoi il apparaît essentiel de poursuivre ces travaux qui pourraient amener des avancées importantes dans le domaine de l'écotoxicologie aquatique et qui pourraient contribuer à expliquer un débalancement des rétinoïdes et un déclin des amphibiens. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Amphibiens, Rana catesbeiana, Contaminants agricoles, Rétinoïdes, Rétinol, Esters de rétinol, RBP, TTR, pesticides, écotoxicologie aquatique.