Les plantes médicinales sont une importante source thérapeutique partout dans le monde. Leur consommation repose pour une bonne part sur la croyance populaire voulant que les produits qui en sont dérivés puissent être consommés en toute sécurité. Cependant, les études portant sur les propriétés phytochimiques ou biologiques de plusieurs produits végétaux ont démontré l'action et le potentiel toxique de ces produits sur les systèmes cellulaires des mammifères. Par ailleurs, la consommation de métabolites végétaux pendant la grossesse est peu étudiée et on ne connaît pas l'action de ces produits sur le processus de placentation. Le placenta humain est à la fois un organe multifonctionnel indispensable au développement embryonnaire et une barrière non sélective au passage des substances entre la mère et le fœtus. Le processus de placentation humain mène à la formation d'un type de placenta où le sang maternel n'entre pas en contact direct avec le sang fœtal et le transfert de nutriment est fait à travers les cellules nommées syncytiotrophoblastes. En plus de produire les hormones qui assurent le maintien de la grossesse, ces cellules constituent un important site pour la régulation de l'homéostasie calcique fœtale dans laquelle sont impliqués plusieurs mécanismes de transfert. En nous basant sur les rapports de littérature scientifiques faisant état des interactions entre les composants présents dans certains végétaux et les structures cellulaires chez les mammifères, nous avons émis l'hypothèse que les produits d'origine végétale peuvent affecter la différenciation cellulaire et le transport du Ca2+ par les cellules trophoblastiques. Ainsi, la présente thèse a pour but de caractériser l'effet de plantes médicinales sur la différenciation et sur le transport de Ca2+ par ces cellules in vitro. Pour la réalisation des tests biologiques, nous avons utilisé comme modèle in vitro les cellules de lignée JEG-3 et BeWo. Pour cette étude, les extraits bruts de trois plantes médicinales ont été choisis en fonction des critères taxonomique et ethopharmacologique; il s'agit de Hypericum perforatum, Genipa americana et Lantana macrophylla. Nous avons aussi observé l'effet de l'hypericine, une antraquinone isolée de Hypericum perforatum qui sert à standardiser l'extrait brut commercial. La caractérisation de l'effet de ces plantes sur la différenciation et le transport du Ca2+ a été réalisée à travers le dosage de l'hormone hCG, la fusion cellulaire, l'activation des voies de signalisation impliquées dans la différenciation cellulaire, l'influx de Ca2+ et la régulation génomique à travers l'expression des protéines de liaison et de transport du Ca2+. Aussi, nous avons réalisé la caractérisation chimique de Genipa americana et Lantana macrophylla. De façon générale, les trois plantes étudiées ont affecté le système cellulaire des trophoblastes in vitro. Les résultats obtenus de l'étude de Hypericum perforatum et hypericine ont démontré que, de manière différenciée, ces deux produits peuvent affecter l'influx de Ca2+ intracellulaire des cellules JEG-3 à travers la régulation de l'expression des protéines du transport du Ca2+. Les résultats de l'effet de Genipa americana sur les cellules BeWo ont démontré que l'extrait éthanolique de cette plante peut affecter la viabilité/prolifération cellulaire et interférer dans la voie de signalisation de MAPK; la présence unique de stéroïdes dans l'extrait éthanolique des fruits de Genipa americana indique probablement une action de ces métabolites sur les voies de MAPK. L'étude de l'effet de l'extrait éthanolique des feuilles de Lantana macrophylla sur l'influx du Ca2+ de cellules JEG-3 a indiqué une importante action de cet extrait sur l'homéostasie calcique caractérisée par l'augmentation de la concentration interne de Ca2+ et aussi par l'augmentation de l'expression des protéines liant le calcium; par ailleurs, l'activation des voies des MAPK à court et long terme ainsi que la diminution significative de l'hormone hCG ont démontré son interférence sur la différenciation des cellules BeWo. De plus, la caractérisation chimique de l'extrait de Lantana macrophylla a révélé la présence de trois triterpènes: les acides oléanolique, ursolinique et lantanolique, ce qui indique l'implication de ces substances dans l'homéostasie et la différenciation des cellules trophoblastiques. En conclusion, nous avons pu démontré, avec l'utilisation des modèles in vitro JEG-3 et BeWo, l'effet toxique distinctif de certaines plantes médicinales sur la formation et la fonction du placenta. L'ensemble des résultats indique que ces produits d'origine végétale peuvent induire des effets défavorables à la formation du placenta et/ou au développement du fœtus pendant la grossesse. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : trophoblastes, plantes médicinales, transport du calcium, différenciation cellulaire.

Thèse de doctorat : Biologie moléculaire : Strasbourg 1 : 2007. / Thèse soutenue sur un ensemble de travaux. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. f. 116-131.

Thèse de doctorat : Sciences de la vie et de la santé : Tours : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre.

Le Zinc (Zn) est un métal important pour de nombreux processus physiologiques, notamment dans le métabolisme osseux. Cette étude a pour objectif d'évaluer l'implication possible de transporteurs de zinc (ZIP) dans l'influx de Cd dans la cellule. Le cadmium (Cd), métal cancérigène pour l'homme est suspecté d'emprunter certains ZIP, en particulier ZIP4 responsable de l'absorption intestinale du Zn, par mimétisme ionique. Des études montrent que ZIP8 participe à l'accumulation de Cd dans certains tissus. Parallèlement à la lignée cellulaire intestinale Caco-2, indifférenciés (J7) et différenciés (J21), la lignée ostéoblastique MG63 a été choisie. L'expression d'acide ribonucléique messager (ARNm) de ZIP 1, 4, 8 et hZTL1 a été déterminée par transcription inverse et polymérisation en chaîne (RT-PCR). Dans les cellules Caco-2, l'expression de ZIP8 et de hZTL1 est stable, celle de ZIP4 augmente avec la différenciation tandis que l'expression de ZIP1 diminue avec celle-ci. Les cellules MG63 expriment les ZIP et hZTL1 à des niveaux comparables. La détection par immunofluorescence de ZIP4 à la membrane des cellules Caco-2 confirme les résultats obtenus par RT-PCR. Le transport de 109Cd (0.5 µM) a été mesuré dans plusieurs conditions expérimentales afin de tester une éventuelle compétition entre le Zn, le Cd et le manganèse (Mn). Dans les cellules Caco-2 (J7, J21), les pourcentages d'inhibition (70% du transport saturable) par le Zn et le Mn sont comparables. Dans les cellules MG63, l'accumulation de 109Cd est plus fortement inhibée par le Zn que par le Mn. L'ajout de HCO3- augmente l'inhibition par le Zn et le Mn. Ces résultats suggèrent que ZIP8 et ZIP4 sont impliqués en partie dans l'accumulation de Cd. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : cellules Caco-2, cellules MG63, zinc, ZIP4, ZIP8, cadmium

Thèse (D. en biochimie)--Université du Québec à Montréal, 2005. / En tête du titre: Université du Québec à Montréal. Comprend des réf. bibliogr. Publié aussi en version électronique.

Encore aujourd'hui, l’expression de protéines recombinantes dans les cellules de mammifères se fait principalement par transfection d’acides nucléiques codant pour cette protéine. Or, une alternative, la livraison directe de protéines, suscite un intérêt grandissant depuis près de trente ans, avec la découverte de séquences peptidiques ayant la capacité de pénétrer les cellules et de déstabiliser les membranes. Ainsi, des stratégies de livraison de protéines employant ces peptides se sont détachées des systèmes synthétiques tels que les polymères et les lipides cationiques. Parmi ces peptides, on retrouve notamment, d’une part, les peptides de pénétration cellulaire (Cell Penetrating Peptides - CPP) qui sont capables d’amener une protéine liée dans la cellule par endocytose, mais peinent à franchir la barrière endosomale ; d'autre part, des peptides de fuite des endosomes (Endosomal Leakage Domains - ELD), permettant de déjouer ce goulot d’étranglement de la livraison. Cette thèse s'intéresse principalement à l’étude de la livraison de protéines via la combinaison de CPP et d’ELD. Une avenue d'intérêt qui a été identifiée consiste à co-incuber les cellules avec différentes combinaisons d'un mélange de ces peptides avec la protéine à livrer, sans liaison covalente. Ainsi, les peptides CPP-ELDs ont permis de livrer la protéine fluorescente GFP seule, mais aussi la GFP fusionnée à un domaine d’importation nucléaire qui a pu rejoindre le noyau de divers types cellulaires. En particulier, le peptide 6His-CM18-PTD4 a été particulièrement investigué pour la livraison de diverses protéines d’intérêt. 6His-CM18-PTD4 a permis la livraison du facteur de transcription HoxB4 ainsi que des nucléases Cas9 et Cpf1 pour réaliser leur fonction d’édition génomique. Les propriétés et mécanismes de livraison des CPP-ELDs ont été étudiés. Ainsi, des mécanismes d’endocytose et de translocation directe vers le cytoplasme ont été identifiés et étudiés. La répartition entre ces voies d’entrée cellulaire peut varier suivant la nature du peptide CPP-ELD ou de divers facteurs de livraison tels que sa concentration. Globalement, les mécanismes de livraison ont été étudiés par l’emploi de la protéine GFP et d’autres sondes fluorescentes (calcéine, FITC-dextranes). Les CPP-ELDs sont capables de livrer des molécules de petite taille (600 Da) jusqu’à des poids moléculaires importants (250 kDa). Cette capacité à livrer de grandes protéines a été validée par l’entrée cellulaire des nucléases Cas9 et Cpf1, ainsi que d’anticorps. L’analyse de la composition ainsi que des structures secondaires supposées a permis d’identifier des critères nécessaires pour l’efficacité de livraison dans les cellules de mammifères pour des applications de recherche et thérapeutiques. / The expression of proteins in mammalian cells is still today mostly done by transfection of nucleic acids coding for the protein. An alternative, the direct delivery of proteins, has roused a growing interest for the past thirty years, since the discovery of peptide sequences with the capacity to penetrate the cells and destabilize the membranes. Thereby, strategies of protein delivery associating these peptides to the cargo protein differentiate from synthetic systems like cationic polymers and lipids. Among these peptides are found Cell Penetrating Peptides (CPP), which are able to bring a linked protein to the cell by endocytosis, but lack to cross the endosomal barrier. We also find peptides, which permit the endosomal escape of a cargo, the Endosomal Leakage Domains (ELD), in order to evade this bottleneck. This thesis is interested in the study of protein delivery, by means of the combination of CPP and ELD. An identified way of interest consists in co-incubating the mammalian cells with different combinations of a mix of these peptides with the protein to be delivered, without covalent link. Thereby, the CPP-ELDs permitted the delivery of the GFP fluorescent protein alone, as well as the GFP in fusion with a nuclear localization domain, which was found in the nuclei of several cellular types. In particular, the 6His-CM18-PTD4 peptide has been notably investigated for the delivery of various proteins. It enabled the delivery of the HoxB4 transcription factor, as well as the Cas9 and Cpf1 nucleases to realize their genome editing function. The properties and mechanisms of CPP-ELDs have been studied. Therefore, the endocytosis mechanism and the direct translocation to the cytoplasm have been identified and studied. The balance between these cellular pathways can vary depending on the nature of the CPP and the ELD, and on the delivery factors such as the peptide concentration. Overall, the delivery mechanisms have been studied by using GFP protein, and other fluorescent probes (calcein and FITC-Dextrans). The CPP-ELDs are able to deliver small size molecules (600 Da) to molecules with high molecular weight (250 kDa). The capacity to deliver big proteins has been confirmed by the cellular entry of the Cas9 and Cpf1 nucleases, but also with antibodies. The analysis of the biochemical properties and assumed secondary structures allowed identifying several criteria required for the efficient delivery in mammalian cells, for discovery and therapeutic applications.

Le peptide apparenté à la parathormone (PTHrP) est un régulateur important du transport de calcium placentaire durant la gestation. Une concentration adéquate de calcium est requise afin d'assurer la croissance et le bon développement du foetus. Dans la présente étude, l'impact d'une délétion en PTHrP ou en son récepteur (PTH1R) a été mesuré dans le placenta de souris. L'usage d'un tel modèle animal a permis d'évaluer l'importance de la PTHrP dans le transport de calcium placentaire mais également les répercussions de telles délétions sur l'expression d'ARNm des protéines de manutention du calcium («calcium handling proteins») présentes dans le placenta (TRPVs, CaBPs, PMCAs, NCXs, TCTP et VDR). Les mesures de calcium ionisé récoltées dans le sang foetal et maternel ont été effectuées in situ en utilisant un analyseur à électrolytes et de sang total. L'évaluation des niveaux d'expression d'ARNm des différentes protéines de manutention du calcium a été rendue possible grâce à la technique de PCR en temps réel. Les résultats obtenus ont démontré que la perte en PTHrP ou en PTH1R engendre une réduction significative du calcium ionisé dans la circulation foetale. Le niveau de calcium ionisé mesuré, chez les foetus ayant subi une délétion en PTHrP ou en PTH1R, est inférieur à celui de la souche sauvage mais équivalent à celui des mères. Dans les placentas de souris délétées en PTHrP, l'expression des gènes de TRPV6 et de TCTP est augmentée contrairement à celle des placentas de la souche sauvage. La délétion du récepteur PTH1R a eu une influence remarquable sur l'expression des médiateurs de calcium CaBP-9k et TCTP mais également sur le récepteur à la vitamine D (VDR). Toujours en comparaison avec les placentas de la souche sauvage, le TCTP et le VDR se sont vus réprimés dans les placentas délétés en PTH1R. L'expression du TRPV5, responsable de l'intrusion du calcium dans le placenta, a également été réduite. D'un autre côté, l'expression d'ARNm de la CaBP-9k a doublé par rapport au niveau d'expression basal lors d'une dysfonction du récepteur. Ces données démontrent donc que la TRPV6 et le TCTP sont les principales protéines de manutention du calcium réagissant à une délétion de la PTHrP. Dans les placentas délétés en PTH1R, aucune variation dans l'expression des ARNm des canaux responsables de l'expulsion du calcium vers la circulation foetale (les PMCA et les NCX) a été remarquée. Pour ce qui est de l'expression de l'ARNm des TRPV, responsables de l'entrée de calcium vers le placenta, elle s'est vue diminuer pour TRPV5 mais inchangée pour TRPV6. Encore une fois, dans ces placentas, l'expression des médiateurs de calcium intracellulaire a été réduite pour le TCTP, inchangée pour la CaBP-28k mais augmentée dans le cas de la CaBP-9k. En conclusion, le transport de calcium placentaire est sans aucun doute réduit lors d'une délétion en PTHrP ou en PTH1R. L'expression des ARNm des protéines de manutention du calcium présentes dans le placenta varie suite à la perte de la PTHrP ou du récepteur PTH1R. Étonnamment, aucune modification significative n'a été constatée dans l'expression des ARNm des protéines responsables de l'extrusion du calcium. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Placenta, Calcium, PTHrP, PTH1R, «Calcium handling proteins».

Certains métaux peuvent agir comme perturbateurs endocriniens: les truites arc-en-ciel vivant dans les lacs contaminés au cadmium (Cd) ou au zinc (Zn) présentent une sécrétion cortisolique affaiblie en réponse au stress comparativement à celles non exposées. Des études in vitro ont révélé que le Cd et le Zn agissent directement sur la cellule adrénocorticale et nous avons démontré que le ¹⁰⁹Cd est transporté dans ces cellules par un système de transport spécifique. Comme la sécrétion cortisolique en réponse à l'adrénocorticotrophine (ACTH) impliquerait un influx de calcium (Ca), nous avons émis l'hypothèse que le Cd et le Zn inhiberaient cet influx. Les effets réciproques du Cd et du Ca, ainsi que du Zn, sur le transport de ¹⁰⁹Cd et de ⁴⁵Ca ont été caractérisés dans des cellules adrénocorticales isolées de truites d'élevage. Nous avons utilisé des milieux d'incubation inorganiques et avons analysé les résultats en terme de spéciation des métaux. Nos résultats démontrent l'existence d'un transport spécifique pour le ⁴⁵Ca. Des inhibitions réciproques entre le Cd et le Ca ont été observées en conditions optimisant les niveaux de Cd²⁺ comparativement aux chloro-complexes (CdCln²¯n). Le Zn inhibe préférentiellement le transport de ¹⁰⁹CdCln²¯n sans affecter l'accumulation de ⁴⁵Ca. Le Cd pourrait donc perturber la sécrétion de cortisol en diminuant la biodisponibilité du Ca dans les cellules stéroïdogéniques du tissu interrénal, mais il est peu probable que le Zn agisse ainsi. Le transport de ¹⁰⁹Cd étant inhibé par le Zn, ces deux métaux n'agiraient pas en synergie sur la fonction hormonale. Cette étude valide l'utilisation de cellules adrénocorticales isolées pour mieux comprendre la défaillance cortisolique observée chez les poissons vivant en écosystèmes contaminés. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Cadmium, Zinc, Calcium, Cortisol, Spéciation, Inhibition réciproque.

Thèse (D. en biochimie)--Université du Québec à Montréal, 2005. / En tête du titre: Université du Québec à Montréal. Comprend des réf. bibliogr. Publié aussi en version électronique.

Thèse (D. en biochimie)--Université du Québec à Montréal, 2006. / En tête du titre: Université du Québec à Montréal. Comprend des réf. bibliogr. Publié aussi en version électronique.