Thèses (M.Sc.)--Université de Sherbrooke (Canada), 2001. / Titre de l'écran-titre (visionné le 17 juillet 2006). Publié aussi en version papier.

Thèse de doctorat--Sciences naturelles--Faculté des sciences de Paris, 1911. N°: 1439. / Extrait des "Archives de zoologie expérimentale et générale". 5e série, T. IX. Notes bibliogr.

Reproductin de : Thèse de doctorat : Immunologie : Lyon 1 : 2006. / Titre provenant de l'écran titre. 410 réf. bibliogr.

Thèses (M.Sc.)--Université de Sherbrooke (Canada), 1999. / Titre de l'écran-titre (visionné le 20 juin 2006). Publié aussi en version papier.

Th.--Méd.--Nancy 1, 1984. N°: 90.

Th.--Biomath.--Toulouse--I.N.P., 1982. N°: 63.

Th. 3e cycle--Prod. vég. et qualité des produits--Toulouse--I.N.P., 1979. N°: 54.

L’infection par le cytomégalovirus (CMV) constitue une des complications majeures de la transplantation de moelle osseuse pédiatrique. Le ganciclovir (GCV) reste aujourd’hui le traitement de choix mais sa toxicité sur les cellules sanguines rend son utilisation délicate. L’objectif de l’étude était d’évaluer in vitro des schémas posologiques plus courts et plus intenses que ceux utilisés actuellement in vivo (traitements de 14 jours au minimum avec concentrations minimales plasmatiques cibles de 1-2 mg/L) en terme d’efficacité et de toxicité. L’influence de l’intensité (1 à 20 mg/L) et de la durée d’exposition (1 à 14 jours) sur l’activité antivirale et la toxicité a été étudiée à partir d’un modèle de culture de cellules lymphoblastoïdes, infectées ou non par le CMV. Une relation concentration/toxicité (numération cellulaire) a été mise en évidence pour des durées d’exposition supérieures à 2 jours. Cette toxicité semble liée à la formation de GCV triphosphate (métabolite actif), détecté par méthode chromatographique couplée à la spectrométrie de masse. Des expositions de 1 à 2 jours ont paru aussi efficaces (mesure de la charge virale) que des expositions plus longues pour des concentrations de 5 à 20 mg/L. Ces résultats montrent pour la première fois l’influence majeure de la durée d’exposition sur la toxicité cellulaire in vitro et incitent à limiter la durée des traitements. L’intégration des données dans un modèle mathématique permettra de déterminer un schéma thérapeutique optimal, à tester chez l’enfant dans le cadre d’un essai clinique. Il devrait permettre d’améliorer la prise en charge des infections à CMV chez l’enfant immunodéprimé. / Human cytomegalovirus infection is still a major complication after pediatric bone marrow transplantation and can be fatal in some cases. Ganciclovir (GCV) remains the standard treatment after pediatric bone marrow transplantation even though it has a high toxicity on hematological cells. The aim of the current in vitro study was to evaluate therapeutic schedules shorter but more intensive than those actually used in vivo (14 days with target through plasma concentrations between 1 and 2 mg/mL). The impact of the intensity (1 to 20 mg/L) and duration (1 to 14 days) of GCV exposure on toxicity and effectiveness has been studied based on lymphoblastoid cell culture; infected or not with CMV. A correlation between the dose of GCV exposure and toxicity (cell counting) was found when duration of exposure exceeds 2 days. Toxicity was due to metabolism of GCV as GCV triphosphate (detection by chromatographic method coupled with mass spectrometry). Shorter durations of exposure (1 and 2 days) seemed to be as effective (viral load measurement) as longer duration of exposure for GCV concentrations between 5 and 20 mg/L. This study demonstrates for the first time that GCV exhibits a duration-dependent toxicity on hematopoietic derived cells when in vivo doses of the drug are used. They show the interest to limit the duration of treatment. Results will be integrated in a mathematical model to determine the optimal therapeutic schedule. This new regimen will be tested in a paediatric clinical trial. It should improve CMV infection treatment in immune-depressed paediatric patients.

Les microtubules (MTs) sont des éléments majeurs du cytosquelette, ils participent à un ensemble de fonctions cellulaires d’importance comme la migration, le trafic des vésicules et des organelles ainsi qu’{ la division cellulaire au cours de laquelle ils forment le fuseau mitotique, permettant une ségrégation correcte des chromosomes. Ce sont des polymères cylindriques composés de protofilaments parallèles faits d’hétérodimères de tubulines α/β. Pour exercer ces fonctions, les MTs nécessitent une dynamique d’assemblage et de désassemblage régulée.La stathmine est une phosphoprotéine cytosolique de 17 kDa qui séquestre la tubuline dans un complexe non polymérisable formé de deux hétérodimères de tubuline par molécule de stathmine (complexe T2S). Les autres protéines de la famille stathmine (SCG10, SCLIP, RB3 et ses deux variants d’épissage RB3' et RB3″) forment aussi des complexes de séquestration appelés T2-SLD (Stathmin Like Domain) ayant des stabilités variables.En s’appuyant sur ces observations, des travaux ont montré qu’une chimère SN-CR constituée de la partie N-terminale de la stathmine et de la partie C-terminale du SLD de la protéine RB3 forme un complexe T2S remarquablement stable avec la tubuline (Jourdain et al., 2004). En parallèle à ces travaux, Clément et collaborateurs ont découvert que de courts peptides issus de la région N-terminale des SLD peuvent à eux seuls inhiber la polymérisation de la tubuline. Le peptide le plus efficace est le peptide I19L issu de la stathmine (peptide I19L (IQVKELEKRASGQAFELIL)). Il correspond à la région repliée en «β-hairpin» observée dans les cristaux T2S-SLD formés avec le domaine RB3-SLD (Clement et al., 2005). Pour augmenter l'efficacité de l’interaction entre les peptides issus de la région N-terminale des SLD et la tubuline, différentes mutations ont été introduites au niveau du peptide I19L. Les expériences de polymérisation in vitro de tubuline en présence d’une série de mutants de peptide I19L montrent que les peptides I19L-K4R et I19L-K4R-A10R sont les plus efficaces pour l’inhibition de l’assemblage de la tubuline.L’objectif de mes travaux { été d’introduire ces mutations au niveau de la partie N-terminale de la protéine stathmine et de la chimère NS-CR, afin d’analyser leurs efficacités sur l’inhibition de l’assemblage des MTs et la dynamique des MTs dans des cellules en culture de type HeLa, et de voir leur impact sur le cycle cellulaire.Mes résultats montrent que la stathmine mutant 2 (possédant les mutations K9R-A15R homologues aux mutations K4R-A10R du peptide I19L) induit une dépolymérisation des MTs dans des cellules en mitose par formation de fagots de MTs, réduit la dynamique de MTs et induit une cytotoxicité. L’ensemble des résultats suggère que nous pouvons améliorer la stabilité de liaison de la stathmine avec la tubuline par l’introduction de ces mutations, ce qui aurait in vitro un impact dans certains aspects cellulaires comme la prolifération cellulaire et la dynamique des MTs. Cela pourrait conduire à développer de nouvelles stratégies anticancéreuses visant à perturber le fuseau mitotique. / Microtubules (MTs) are major constituents of the cytoskeleton and are involved in many cellular processes such as the determination of cell architecture, the formation of the mitotic spindle and intracellular trafficking. These tubular structures, composed by tubulin α/β heterodimers assemble and disassemble with a finely regulated dynamics.Stathmin is a cytosolic phosphoprotein that sequesters tubulin in a non polymerizable complex consisting of two tubulin heterodimers per stathmin molecule (T2S complex).The other stathmin family proteins (SCG10, SCLIP, RB3 and its two splice variants RB3 'and RB3 ") can also bind two tubulin heterodimers through their SLD (Stathmin Like Domain), but the different tubulin/SLD complexes display varying stabilities.Based on these observations, current works showed that one chimera protein consisting of the N-terminal domain of stathmin (NS) and of the C-terminal domain of RB3 (CR) forms a T2-SLD complex remarkably stable with tubulin (NS-CR chimera). Molecular simulation experiments in silico suggest that we can increase the affinity of the NS-CR chimera by introducing mutations in the NS subdomain (Jourdain et al., 2004).In parallel to this work, Clement and colleagues found that short peptides derived from the N-terminal region of SLD alone can inhibit tubulin polymerization. Among the N-terminal part of SLD, the most effective peptide is the peptide I19L (IQVKELEKRASGQAFELIL) derived from stathmin. It corresponds to region folded into a "β-hairpin" structure observed in the T2S crystals (Clement et al., 2005). To increase the efficiency of this interaction, different mutations were introduced at the level of the I19L peptide from the stathmin N-terminal domain and tested in vitro. The results showed that the peptides I19L-K4R and I19L-K4R-A10R are the most effective to in inhibit the assembly of MTs.In this work, we introduce these mutations in the N-terminal domains of stathmin and in the NS-CR chimera with the aim of analyzing their efficiencies on MTs disassembly in cancer cell cultures like HeLa, and the impact of the mutation on MTs dynamic and cell cycle.Results from overexpression experiments of WT and stathmin mutant 2 containing the double mutation (K9R-A15R similar to the mutations K4R-A10R for the I19L peptide), suggest that this mutant significantly induces depolymerization of mitotic MTs. In its less phosphorylated state on serine 16; this mutation also reduces MTs dynamics and induces cytotoxicity.We thus suggest that we can ameliorate the binding and efficiency of the N-terminal stathmin part by including this double mutation. This variation has an impact in vitro and in some cellular aspects such as cell proliferation and MTs dynamics. These findings may lead to a targeted therapy for this type of cancer.

Les DC (cellules dendritiques) ne représentent qu’environ 0.5% des cellules circulantes dans le sang humain, mais sont les meilleures cellules présentatrices d’antigène (CPA) de l’organisme. (Article 1, revue sur les DC tolérogènes, Bio-Medical Materials and Engineering, 2006) Du fait de cette faible proportion, la production de DC in vitro en grande quantité peut s’avérer nécessaire pour des programmes d’immunothérapie visant à stimuler un système immunitaire déficient. Au laboratoire, nous avons établi une nouvelle méthode pour produire très efficacement des DC à partir de cellules souches hématopoïétiques CD34+ sans nécessité de purification des cellules CD34+. Nous avons pu démontrer que les DC obtenues partagent des caractéristiques phénotypiques, morphologiques et également fonctionnelles avec les DC obtenues par des méthodes traditionnelles. De plus, le rendement d’obtention des DC était bien meilleur que celui des méthodes traditionnelles. (Article 2, J Leuko. Biol., 2007) Une autre caractéristique des DC est leur capacité à induire non pas une réponse immunitaire forte, mais au contraire une tolérance. Il a été montré que les CSM peuvent inhiber la différenciation des DC et jouer un rôle important dans la modulation de la réponse immunitaire. Nous avons donc cherché à préciser les fonctions des DC différenciées en présence de CSM et les mécanismes concernés par cette inhibition. Nous avons démontré que les CSM inhibent la différenciation des CSH CD34+ en DC immunocompétentes. Les DC obtenues ainsi sont tolérogènes, et, à leur tour induisent la génération de lymphocytes T régulateurs. L’activation du signal via la voie Notch est un mécanisme important dans l’inhibition exercée par les CSM. (Article 3, J Immunol, 2008) Parallèlement à ce travail, nous avons étudié l’impact de la réponse allogénique sur la différenciation des DC à partir des monocytes. Nous avons montré que le surnageant allogénique provenant de cultures mixtes lymphocytaires peut induire la génération de DC tolérogènes exprimant fortement d’ILT3, et ainsi inhiber la réponse immunitaire en induisant la production de lymphocytes T régulateurs. (Article 4, en préparation) / Thesis