L'utilisation de lignées de soya possédant différents gènes Rps (« Resistant to Phytophthorasojae ») demeure la meilleure méthode de lutte pour combattre la pourriture phytophthoréenne. La résistance conférée par les gènes Rps repose sur le concept gène-pour-gène où une relation existe entre un gène de résistance (gène Rps) chez la plante et un facteur d'avirulence correspondant (gène Avr) chez l'agent pathogène. Sept gènes Rps ont été introduits avec succès dans les cultivars commerciaux, soit les gènes Rps1a, Rps1b, Rps1c, Rps1d, Rps1k, Rps3a et Rps6. À long terme, l'agent pathogène arrive à contourner la résistance conférée par ces différents gènes Rps par la diversification génétique de ces gènes d'avirulence, entraînant la complexification des pathotypes de P. sojae. Afin d'exploiter efficacement ce type de résistance, il devient donc primordial de pouvoir identifier ces pathotypes pour connaître l'interaction des différentes souches de P. sojae avec les gènes Rps utilisés. Ce projet de doctorat avait donc comme objectif une meilleure compréhension de la diversité haplotypique des populations de P. sojae, concernant l'interaction avec les gènes Rps d'intérêt commercial, afin de permettre aux producteurs de faire un choix éclairé qu and vient le temps de choisir des lignées résistantes à la maladie. Dans un premier volet de recherche, notre hypothèse stipulait que l'analyse des variations nucléotidiques et structurales associées aux sept principaux gènes d'avirulence de P. sojae permettrait d'identifier le spectre des haplotypes associés aux phénotypes des isolats, relativement à leur compatibilité avec les gènes de résistance Rps correspondants. Le séquençage du génome complet de 31 isolats représentant la diversité des pathotypes canadiens a permis d'identifier les différents haplotypes des sept principaux gènes d'avirulence (1a, 1b, 1c, 1d, 1k, 3a et 6) et d'y associer un profil de virulence pour chaque gène Rps correspondant. L'utilisation d'une méthode de phénotypage en bassin hydroponique a permis de constater que le test traditionnel d'inoculation de l'hypocotyle menait à une proportion importante de faux positifs, ce qui a pu nuire à la compréhension de certaines interactions Rps-Avr par le passé. Notre étude a révélé que l'utilisation unique des signatures génomiques permettait de prédire 99,5 % des interactions possibles et que ces dernières pouvaient donc être utilisées pour prédire précisément le profil de virulence des isolats de P.sojae. Ces résultats ont mené à notre deuxième volet de recherche qui visait à démontrer que les marqueurs discriminants identifiés dans le premier volet de l'étude permettraient de s'affranchir du test de phénotypage, par le développement d'un outil moléculaire de type multiplex PCR, capable de prédire le pathotype des isolats de P. sojae. Des amorces spécifiques permettant d'amplifier les allèles associés à l'avirulence envers chaque gène Rps ont été conçues et multiplexées. Le multiplex PCR développé a démontré une efficacité de 97 % lorsque testé sur un panel d'isolats au profil inconnu de virulence. Le troisième volet de recherche visait à mieux comprendre l'interaction de P. sojae avec le gène de résistance Rps8. Notre hypothèse suggérait que l'avirulence de P. sojae envers le produit du gène de résistance Rps8 était déterminée par un effecteur RXLR, codé par un gène d'avirulence correspondant. L'analyse d'une descendance F2 en ségrégation par génotypage par séquençage couplée à l'utilisation des données de séquençage des 31 isolats de P. sojae a permis de cibler Avr3a comme le meilleur gène candidat. En utilisant la méthode d'édition de génome médiée par CRISPR/Cas9, nous avons démontré que le knock-out complet du gène Avr3a chez P. sojae induisait un gain de virulence envers Rps8. Nous avons aussi démontré qu'un allèle spécifique d'Avr3a était reconnu de façon différentielle par Rps3a et Rps8, ce qui représente la première distinction nette entre ces deux gènes de résistance. L'ensemble de ce projet de doctorat a permis de fournir de nouvelles informations sur la complexité des gènes Avr en plus de démontrer que leurs signatures génomiques pouvaient être utilisées pour prédire précisément l'interaction de l'agent pathogène avec les différents gène Rps du soya. Le développement d'un test moléculaire simple et précis offre aux producteurs et sélectionneurs une solution concrète afin d'exploiter efficacement l'utilisation des gènes Rps. L'identification du gène d'avirulence reconnu par Rps8 permet également d'avoir une longueur d'avance dans la gestion de la maladie, en prévision de l'apparition inévitable de nouveaux pathotypes dans le futur. / The use of soybean lines with different Rps ("Resistant to Phytophthora sojae") genes remains the best control method to control Phytophthora root rot. The resistance conferred by Rps genes is based on the gene-for-gene concept where a relationship exists between a resistance gene (Rps gene) in the plant and a corresponding avirulence factor (Avr gene) in the pathogen. Seven Rps genes have been successfully introduced into commercial cultivars, namely Rps1a, Rps1b, Rps1c, Rps1d, Rps1k, Rps3a and Rps6. In the long term, the pathogen manages to by pass the resistance conferred by these different Rps genes by the genetic diversification of its avirulence genes, leading to the complexification of P. sojae pathotypes. To effectively exploit this type of resistance, it is therefore essential to be able to identify those pathotypes in order to know the interaction of the different strains of P. sojae with the Rps genes in use. This doctoral project aims to have a better understanding of the haplotypic diversity of P. sojae populations, concerning their interaction with the Rps genes of commercial interest, in order to allow producers to make an informed choice when the time comes to choose soybean lines resistant to the disease. In a first approach, our hypothesis stipulated that the analysis of the nucleotide and structural variations associated with the seven main avirulence genes of P. sojae would allow the identification of the spectrum of haplotypes associated with the phenotypes of the isolates, relative to their compatibility with the corresponding Rps resistance genes. The whole-genome-sequencing of 31 isolates representing the diversity of Canadian pathotypes made it possible to identify the different haplotypes of the seven main avirulence genes (1a, 1b, 1c, 1d, 1k, 3a and 6) and to associate a virulence profile for each corresponding Rps gene. The use of a hydroponic phenotyping method showed that the traditional hypocotyl inoculation test leads to a high proportion of false positives, which could have hampered the understanding of certain Rps-Avr interactions in the past. Our study found that the unique use of genomic signatures predicted 99.5% of the possible interactions and that these could therefore be used to accurately predict the virulence profile of P. sojae isolates. These results led to the second part of this doctoral project, which aimed to demonstrate that the discriminating markers identified in the first part of the study would make it possible to bypass the cumbersome phenotyping method by the development of a molecular tool capable of predicting the pathotype of P. sojae isolates. Specific primers for amplifying the alleles associated with avirulence towards each Rps gene were designed and multiplexed. The multiplex PCR developed demonstrated an efficiency of 97% when tested on a panel of isolates with an unknown virulence profile. The third objective of this project was to understand the interaction of P. sojae with the resistance gene Rps8. Our hypothesis suggested that the avirulence of P. sojae towards the Rps8 resistance gene product was determined by an RXLR effector encoded by a corresponding avirulence gene. Analysis of a segregating F2 progeny by using a genotyping-by-sequencing method coupled with the use of sequencing data from the 31 P. sojae isolates led to the identification of Avr3a as the best candidate gene. Using the CRISPR/Cas9-mediated genome editing method, we demonstrated that the complete knockout of the Avr3a gene in P. sojae induced a gain of virulence towards Rps8. We also demonstrated that a specific Avr3a allele is differentially recognized by Rps3a and Rps8, which results in the first clear distinction between those two resistance genes. This doctoral project provided new information about the complexity of Avr genes and demonstrated that their genomic signatures could be used to precisely predict the interaction of the pathogen with the various Rps genes in soybean. The development of a simple and precise molecular test offers to producers and breeders a concrete solution to effectively exploit the use of Rps genes. Identifying the avirulence gene recognized by Rps8 also provides a head start in disease management, in anticipation of the inevitable emergence of new pathotypes in the future.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/71175 |
| Date | 03 January 2022 |
| Creators | Arsenault-Labrecque, Geneviève |
| Contributors | Bélanger, Richard R. (Richard Robert) |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | thèse de doctorat, COAR1_1::Texte::Thèse::Thèse de doctorat |
| Format | 1 ressource en ligne (xx, 118 pages), application/pdf |
| Rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
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