Le large éventail d'applications du système CRISPR-Cas a conduit à des innovations biotechnologiques qui sont sur le point de transformer l'industrie pharmaceutique actuelle. Néanmoins, l'atteinte d'un haut niveau d'efficacité à un gène cible reste encore aujourd'hui un défi pour l'édition du génome. Ceci est dû principalement à la capacité encore limitée de modifier tous les sites du génome humain, tout comme le faible taux de recombinaison homologue obtenu chez les cellules de mammifères. Ainsi, l'optimisation des processus de modification génique s'avère indispensable pour favoriser les diverses utilisations de l'édition du génome. Dans cette thèse, il a été question de (i) développer une méthode d'enrichissement de cellules génétiquement modifiées et (ii) augmenter la polyvalence de l'édition du génome en augmentant la plage de ciblage du système CRISPR-Cas9 dans le génome humain. L'objectif de la première partie de cette thèse visait à étudier la fonctionnalité du gène ATP1A1, codant pour la pompe sodium/potassium (Na⁺/K⁺ ATPase), comme marqueur endogène de l'édition du génome. Dans ce sens, nous avons modifié la sensibilité de cette pompe pour l'ouabaïne en insérant des mutations dominantes dans le locus ATP1A1, ce qui a permis de générer des cellules résistantes à l'ouabaïne. La capacité de multiplexage du système CRISPR-Cas permet de co-cibler simultanément ATP1A1 et le locus d'intérêt, où il est possible d'enrichir des évènements de réparation par NHEJ ou par RH dans les deux locus à la suite de l'ajout d'ouabaïne. Ainsi, nous avons démontré que cette approche peut être appliquée non seulement aux lignées cellulaires, mais aussi aux cellules primaires ce qui permet d'envisager une possible utilisation pour le développement thérapeutique ex vivo. Dans le deuxième objectif de cette thèse, il était question d'optimiser le système CRISPR1-Cas9 de Streptococcus thermophilus dans le but d'élargir le répertoire de nucléases pour l'édition du génome. Dans ce sens, nous avons optimisé l'expression de l'ARN guide et nous avons caractérisé diverses variantes de St1Cas9 permettant de cibler des régions riches en A/T. Autant sous forme de nucléase que d'éditeur de base, l'application de nos variantes de St1Cas9 in vitro a permis d'obtenir des hauts taux d'édition du génome humain. Ainsi, la taille de St1Cas9 est idéale pour sa vectorisation avec son ARN guide dans un seul vecteur adéno-associés (AAV). Dans ce sens, nous avons démontré que l'administration du vecteur AAV-St1Cas9 permet de sauver la létalité et les anomalies métaboliques dans un modèle murin de tyrosinémie héréditaire de type I. En tout, ces travaux illustrent des outils permettant d'augmenter le rendement d'édition et l'ouverture de nouvelles régions géniques pouvant être ciblées à l'intérieur du génome humain à l'aide du système CRISPR-Cas9. Ainsi, nous avons démontré la fonctionnalité des outils développés au cours de ce projet de thèse pour diverses applications ex vivo et in vivo, permettant ainsi d'élargir le potentiel thérapeutique de l'édition du génome.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/72787 |
| Date | 12 March 2022 |
| Creators | Agudelo, Daniel |
| Contributors | Doyon, Yannick |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | thèse de doctorat, COAR1_1::Texte::Thèse::Thèse de doctorat |
| Format | 1 ressource en ligne (xv, 252 pages), application/pdf |
| Rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
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