Plusieurs études ont discuté du potentiel des cystatines en protection des plantes contre les insectes phytophages nuisibles. Ces protéines s'accumulent dans les tissus végétaux soumis à l'herbivorie, où elles exercent leurs fonctions protectrices en réprimant l'activité des protéases sécrétées dans le tube digestif de l'ennemi herbivore. Lorsque retrouvées en abondance dans la plante, les cystatines montrent un effet de protection mesurable, fonction de leur efficacité à interagir avec les protéases digestives de l'insecte. Dans le cas d'une forte inhibition, un déséquilibre fonctionnel est engendré, qui provoque un blocage de la digestion des protéines et une carence nutritionnelle menant à des troubles de développement. Un long processus coévolutif entre la plante et ses ennemis herbivores a mené toutefois à des adaptations métaboliques chez l'insecte en réponse aux inhibiteurs de protéases, qui lui permettent souvent d'éviter l'effet négatif des inhibiteurs ingérés. Pour cette raison, un grand intérêt a été porté au fil des ans à l'amélioration des qualités fonctionnelles des inhibiteurs de protéases par différentes approches du génie des protéines. Plusieurs chercheurs se sont intéressé, en particulier, au cas du doryphore de la pomme de terre (Leptinotarsa decemlineata Say), un insecte ravageur d'importance majeure dans les cultures de pommes de terre à travers le monde. Dans l'optique d'améliorer l'efficacité des cystatines contre les protéases digestives du doryphore, ce projet de thèse avait pour objectif d'explorer le potentiel d'une nouvelle approche du génie des protéines, le design par substitution de boucles' (de l'anglais Loop Replacement Design, ou LRD), pour en générer des variants à efficacité améliorée contre les protéases digestives de l'insecte cible. Un survol de la diversité fonctionnelle des cystatines végétales répertoriées dans la banque génomique GenBank a d'abord été réalisé pour identifier des cystatines candidates à capacités inhibitrices variées, à partir desquelles devaient ensuite être puisés les éléments fonctionnels pour le design des inhibiteurs hybrides. Les éléments fonctionnels sélectionnés ont été 'greffés' sur une cystatine modèle à potentiel inhibiteur modéré, la cystatine de tomate SlCYS8, pour la confection des cystatines hybrides à boucles substituées. Plus spécifiquement, des tests enzymatiques en laboratoire ont permis de confirmer le potentiel de l'approche LRD pour le design de cystatines améliorées. En bref, nos résultats ont démontré une amélioration significative du potentiel inhibiteur de la cystatine SlCYS8 modifiée de manière à inclure les sous-régions fonctionnelles de cystatines à plus fort potentiel inhibiteur, ils ont démontré, à l'inverse, un coût fonctionnel mesurable dans le cas des inhibiteurs hybrides intégrant les régions fonctionnelles de cystatines moins efficaces. Ces résultats confirmaient l'intérêt de l'approche LRD pour le développement de cystatines améliorées contre les protéases digestives d'un insecte nuisible et mettaient en relief, sur le plan biochimique, un découplage fonctionnel des différents éléments structuraux de ces protéines. À la lumière de ces conclusions et en complément au premier volet du projet, un deuxième volet a consisté à déterminer l'influence de la partie restante, ou « charpente » (de l'anglais : scaffold), des cystatines sur leur activité inhibitrice. Pour ce faire, les éléments fonctionnels de la cystatine SlCYS8 ont été greffés aux charpentes structurales d'autres cystatines. L'activité inhibitrice des hybrides générés a été évaluée ensuite pour déterminer si cet élément structural, qui n'est pas un élément fonctionnel à proprement parler, influençait l'activité de l'inhibiteur. En bref, nos données ont montré une influence marquée de la charpente des cystatines sur leur potentiel inhibiteur et la pertinence de considérer cet élément structural comme un « élément fonctionnel secondaire » dans toute stratégie d'ingénierie moléculaire des cystatines à des fins de phytoprotection. En somme, ce projet de thèse aura permis d'établir le potentiel d'une approche LRD pour la production de cystatines hybrides à forte activité inhibitrice contre les protéases digestives du doryphore de la pomme de terre. Nos travaux auront permis aussi de mettre en évidence l'influence, sur le plan fonctionnel, de la charpente protéique des cystatines, un élément structural négligé jusqu'ici dans le design de variants améliorés de ces protéines. Des travaux complémentaires seront maintenant bienvenus pour déterminer le potentiel protecteur des nouveaux hybrides exprimés in planta. Des travaux seront utiles également pour mesurer leur potentiel comme partenaires de fusions traductionnelles, une approche complémentaire aux stratégies actuelles de mutagénèse pour le design d'inhibiteurs de protéases hybrides à spectre d'action étendu.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/73452 |
| Date | 31 May 2022 |
| Creators | Tremblay, Jonathan |
| Contributors | Michaud, Dominique, Goulet, Charles |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | thèse de doctorat, COAR1_1::Texte::Thèse::Thèse de doctorat |
| Format | 1 ressource en ligne (x, 92 pages), application/pdf |
| Rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
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