Haemophilus parasuis és un bacteri de la família Pasteurellaceae. És un
colonitzador del tracte respiratori superior en animals sans i l’agent etiològic de la
malaltia de Glässer. Les soques de H. parasuis presenten diferències en virulència,
que han estat observades tant en infeccions in vivo com en proves de fagocitosi in
vitro amb macròfags alveolars porcins (PAMs).
La patogenicitat de les soques ha estat correlacionada amb la resistència a la
fagocitosi, però els factors de virulència implicats son desconeguts. Per la
identificació dels factors implicats en la resistència a la fagocitosi, es va generar
una llibreria genòmica de la soca virulenta de referència Nagasaki. De la incubació
d’aquesta llibreria amb PAMs, es varen seleccionar dos clons amb gens codificant
dos autotransportadors trimètrics associats a virulència (VtaA), vtaA8 i vtaA9.
Mitjançant citometria de flux, es va aprofundir en el paper d’aquestes molècules en
ambdós clons, els quals van mostrar una menor interacció amb els PAMs. La
producció d’anticossos monoclonals (mAb) contra les proteïnes recombinants
VtaA8 i VtaA9 van permetre determinar‐ne la localització a la superfície dels clons.
Els mateixos mAb detectaren aquestes proteïnes a la superfície de la soca resistent
a la fagocitosi PC4‐6P, però no a la soca avirulenta F9. Addicionalment, estudis amb
microscòpia de fluorescència varen determinar l’efecte de VtaA8 i VtaA9 en el
transport a la ruta endocítica, tot detectant un retard en la co‐localització dels
clons vtaA8 i vtaA9 amb compartiments àcids. Aquests resultats són compatibles
amb una inhibició parcial del transport del bacteri a través de la degradació per
fagosoma. Finalment, els anticossos contra un epítop comú a VtaA8 i VtaA9 van ser
opsonitzadors i varen promoure la internalització de la soca resistent a la
fagocitosi PC4‐6 pels PAMs. Globalment, aquests resultats indiquen que VtaA8 i
VtaA9 són proteïnes de superfície i juguen un paper en la resistència a la fagocitosi.
La infecció de garrins privats de calostre nascuts de part natural amb soques de H.
parasuis va mostrar diferències en el grau de virulència. Es varen emprar quatre
soques de H. parasuis: les soques de referència virulenta Nagasaki i avirulenta
SW114, la soca de camp IT29205 (obtinguda d’una lesió i virulenta en una infecció
anterior) i la soca F9 (aïllada de la cavitat nasal d’un garrí sa). Els animals es varen
inocular per via intranasal amb 107‐108 CFU per individu. Dos animals no infectats s’utilitzaren com a controls. A diferents temps (1, 2, 4 i 7 dies post‐infecció [dpi]),
dos animals de cada grup es varen eutanasiar, i es varen prendre mostres de sèrum
i del fluid bronquialveolar. Mitjançant citometria de flux, es varen analitzar els
macròfags alveolars avaluant l’expressió dels marcadors de superfície CD163,
CD172a, SLAI, SLAII, sialoadhesina, CD14 i SWC8. En funció de la virulència de la
soca es varen poder observar canvis en el fenotip dels macròfags. A la fase inicial
de la infecció (1 dpi), les soques no virulentes SW114 i F9 varen induir major
expressió de CD163, sialoadhesina, SLAII i CD172a que les soques virulentes
Nagasaki i IT29205. A 2 dpi, la situació canvià diametralment. Les soques
virulentes generaren una forta inducció de l’expressió de CD172a, CD163 i
sialoadhesina, seguida a continuació d’un sobtat increment d’IL‐8 i CD163 soluble
a 3‐4 dpi. L’activació primerenca dels macròfags per part de les soques virulentes
podria ser crítica per originar malaltia.
L’associació entre el retard produït per les proteïnes VtaA8 i VtaA9 i la ruta
endocítica, així com el retard en l’activació del macròfag, requereix estudis
ulteriors. / Haemophilus parasuis, a member of the family Pasteurellaceae, is a colonizer of the
upper respiratory tract of healthy pigs and the etiological agent of Glässer’s
disease. Differences in virulence among H. parasuis strains have been widely
observed by different tests, including in vivo infections and in vitro phagocytosis
assays with porcine alveolar macrophages (PAMs).
The pathogenicity of the strains has been correlated with resistance to
phagocytosis, but the bacterial factors implicated are not known. To identify
virulence factors involved in phagocytosis resistance, a genomic library of the
virulent reference strain Nagasaki was produced and exposed to PAMs. After
incubation with PAMs, two clones carrying two different virulent‐associated
trimeric autotransporters (VtaA), vtaA8 and vtaA9, were selected. The role of these
molecules was further investigated and a reduction in the interaction of the two
clones with the macrophages was detected by flow cytometry. Monoclonal
antibodies (mAb) produced against the recombinant VtaA8 and VtaA9 proteins
demonstrated the presence of these proteins on the bacterial surface of the
corresponding clone. The same mAb also detected the proteins on the surface of H.
parasuis phagocytosis‐resistant strain PC4‐6P, but not on the non‐virulent strain
F9. The effect of VtaA8 and VtaA9 in the trafficking of the bacteria through the
endocytic pathway was examined by fluorescence microscopy and a delay was
detected in the localization of the vtaA8 and vtaA9 clones in acidic compartments.
Although VtaA8 and VtaA9 delayed phagocytosis, were not sufficient to completely
inhibit the process. These results are compatible with a partial inhibition of the
routing of the bacteria via the degradative phagosome. Finally, antibodies against a
common epitope in VtaA8 and VtaA9 were opsonic and promoted phagocytosis of
the phagocytosis‐resistant strain PC4‐6P by PAMs. Taken together, these results
indicate that VtaA8 and VtaA9 are surface proteins that play a role in phagocytosis
resistance of H. parasuis.
Infection of snatch farrowed, colostrum‐deprived piglets with different strains of
H. parasuis demonstrated differences in the degree of virulence. We used four
strains of H. parasuis: reference virulent strain Nagasaki, reference non‐virulent
strain SW114, and field strains IT29205 (from systemic lesion and virulent in a previous challenge) and F9 (from nasal cavity of a healthy piglet). The infection
was performed intranasally with 107‐108 CFU per animal. Two non‐infected
animals served as controls. At different times after infection (1, 2, 4 and 7 days
post‐infection [dpi]), two animals of each group were euthanized and
bronchoalveolar lavages and sera were collected. Alveolar macrophages were
analyzed for the expression of surface markers CD163, CD172a, SLAI, SLAII,
sialoadhesin, CD14 and SWC8 by flow cytometry. The phenotype of macrophages
changed along with the infection depending on the virulence of the strain. At early
time‐points (1 dpi), non‐virulent strains SW114 and F9 induced higher expression
of CD163, sialoadhesin, SLAII and CD172a than virulent strains Nagasaki and
IT29205. At 2 dpi, the situation switched to a strong induction of expression of
CD172a, CD163 and sialoadhesin by the virulent strains, which was followed by a
steep increase in IL‐8 and soluble CD163 at 3‐4 dpi. The early delay in macrophage
activation by virulent strains may be critical for disease establishment.
The association between the delay produced by VtaA8 and VtaA9 in the endocytic
route and the delay in macrophage activation needs further study.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UAB/oai:www.tdx.cat:10803/117617 |
| Date | 26 March 2012 |
| Creators | Costa Hurtado, Mar |
| Contributors | Aragón Fernández, Virginia, Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Sanitat i d'Anatomia Animals |
| Publisher | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Source Sets | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 115 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
Page generated in 0.0029 seconds