El bioetanol es un combustible complementario a las gasolinas, producido mediante fermentación de azúcares simples derivados de sacarosa, almidón o celulosa. Debido a su gran abundancia el material celulósico es particularmente atractivo como fuente de combustible. La hidrólisis de la celulosa puede realizase utilizando métodos químicos (ácidos o bases) o enzimáticos. La hidrólisis enzimática genera productos más puros y consume menos energía; sin embargo, debido a su bajo rendimiento se requiere usar grandes cantidades de enzima, lo cual eleva considerablemente los costos de producción.
Las endoglucanasas son glicosil hidrolasas que rompen enlaces β-1,4 en polímeros de glucosa. Actúan sobre enlaces internos de la celulosa amorfa generando su despolimerización. La estructura de las celulasas incluye un módulo catalítico, unido a un dominio que actúa como centro de anclaje a la celulosa, por lo que se le ha denominado Modulo de Unión a Carbohidrato (CBM por su sigla en Inglés). Estudios previos han demostrado que una alta afinidad a celulosa se correlaciona con un aumento en la hidrólisis de ésta. En el presente trabajo se proponen mutaciones en el CBM de la endo β-1,4 glucanasa de Trametes versicolor (TvEG), que aumenten la adsorción de la enzima sobre celulosa, buscando de este modo aumentar la hidrólisis de ésta.
Se generó un modelo tridimensional del CBM de la endoglucanasa de T. versicolor mediante modelación comparativa. La estructura obtenida está formada por tres hojas beta antiparalelas unidas entre sí mediante dos puentes disulfuro. El modelo generado se utilizó para llevar a cabo estudios de Docking Molecular, para identificar regiones de interacción celulosa–CBM.
Usando los resultados de la simulación computacional de la interacción CBM-celulosa, se identificaron dos zonas de unión. La primera concuerda con la reportada previamente para CBM’s de la familia I, mientras que no existen reportes en la literatura sobre interacción de la celulosa con la segunda zona identificada. A continuación se simuló mediante Docking Molecular, la interacción de celulosa con variantes de CBM que contenían diferentes aminoácidos en las posiciones clave de la segunda zona de interacción; los valores de energía libre de unión entregados por la simulación permitieron sugerir tres variantes de secuencia de CBM. Las variantes seleccionadas fueron: variante 1 (G7Y, F10W), variante 2 (G7Y, F10W, G12Q) y variante 3 (G7Y, G9Q, F10W, G12Q), donde G es glicina, Y tirosina, F fenilalanina, W triptófano y Q glutamina.
Se generó un sistema de expresión recombinante de TvEG mediante clonamiento del gen silvestre de la enzima en el vector pET22b(+) y transformación en E. coli BL21(DE3); la proteína se acumuló intracelularmente en forma activa. Las mutaciones planteadas fueron construidas exitosamente mediante mutagénesis sitio dirigida, utilizando la metodología de mutación por extensión de superposición. De esta forma, se deja planteado un sistema de expresión recombinante de las variantes construidas, de modo de en el futuro cuantificar experimentalmente la adsorción de los CBM mutados y validar los resultados del análisis realizado in sílico.
Se concluye que la estrategia utilizada permitió simular apropiadamente la interacción CBM-celulosa. Los resultados permitieron proponer en base a los estudios de DM, una estrategia de doble anclaje del CBM a celulosa, que si bien es cierto debe ser comprobado experimentalmente, resulta ser novedoso. Además, permitió proponer variantes del CBM de TvEG que potencialmente se adsorberán con mayor afinidad sobre celulosa. Si bien estas mutaciones deben ser validadas experimentalmente, fueron planteadas a partir de un diseño racional lo que aumentaría la probabilidad que éstas presenten mayor afinidad a celulosa.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/104415 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Buldrini Oviedo, María Teresa |
| Contributors | Salazar Aguirre, María Oriana, Facultad de Ciencias Físicas y Matemáticas, Departamento de Ingeniería Química y Biotecnología, Salgado Herrera, José Cristián, Lienqueo Contreras, María Elena |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Chile, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ |
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