Tesis para optar el titulo de Doctor en Farmacología / Se ha propuesto el empleo de factores solubles derivados de plaquetas con el
objeto de promover la reparación de tejidos. A pesar que diversos estudios han
evaluado la respuesta de células gingivales y periodontales a fracciones
derivadas de plaquetas, existe un fuerte debate acerca de los efectos ejercidos
por estos factores sobre respuestas celulares relacionadas con la reparación
tisular. En la presente tesis hemos evaluado la respuesta de cultivos primarios
de fibroblastos gingivales de origen humano (FG) estimulados con Plasma rico
(PRP) y pobre en plaquetas (PPP). Se evaluaron diferentes respuestas
celulares que incluyen la contracción de geles de colágeno, migración celular,
diferenciación miofibroblástica, producción de moléculas de matriz extracelular
(MEC) y de enzimas proteolíticas. Para la contracción de geles se utilizaron
cultivos tridimensionales de fibroblastos incorporados en colágeno en presencia
de inhibidores de mateloproteasas de matriz y de la polimerización de actina. La
producción de moléculas de matriz y de proteasas fue evaluada mediante
Western-blot. La actividad de la GTPasa RhoA fue evaluada mediante un
ensayo de “pull-down”. La distribución de actina y de contactos focales fue
analizada mediante inmunofluorescencia. Los niveles de TGF-beta1 fueron
cuantificados mediante ELISA.
Tanto el PRP como PPP estimularon la contracción de geles de colágeno,
proceso que fue revertido por los inhibidores de MMPs y de la polimerización de
actina. PRP y PPP estimularon los niveles de MT1-MMP y TIMP-2, la activación
de RhoA y la remodelación del citoesqueleto de actina. Ambas formulaciones
estimularon la migración celular evaluado mediante tres ensayos funcionales
tales como la migración desde explantes de tejido gingival, la migración en nido
y en sistemas bi-camerales. PRP y PPP estimularon la diferenciación
miofibroblástica, medida a través de la producción de α-SMA, Fibronectina
EDA, colágeno tipo I y periostina. A pesar que TGF-beta1 se encontró más
concentrado en PRP en comparación con PPP, la via de señalización Smad fue
similarmente activada por ambos preparados. El presente estudio muestra que los factores solubles derivados de PRP y PPP
pueden ejercer respuestas celulares similares compatibles con la promoción de
la reparación tisular gingival. Más aun, estos resultados sugieren que PPP
podría tener una acción terapéutica que debería ser estudiada en el futuro. / Platelet derived soluble factors have been proposed as a therapeutic agent to
promote tissue repair. Although several studies have assessed the response of
gingival and periodontal cells to platelet derived fractions, there still strong
debate about the specific role played by these agents on cell responses
involved in wound healing. In the present thesis we have evaluated the
response of primary cultures of human gingival fibroblasts (GF) stimulated with
Platelet rich (PRP) and poor plasma (PPP). Different cells responses including
collagen matrix contraction, cell migration, myofibroblastic differentiation,
production of matrix molecules and proteolytic enzymes were evaluated.
Collagen matrix contraction was assessed using fibroblasts-populated collagen
lattices in the presence of matrix metalloproteinases and actin polymerization
inhibitors. Production of matrix molecules and proteinases was assessed
through Western-blot. RhoA activity was evaluated by means of a pull-down
assay. Actin distribution and focal adhesions were assessed through
immunofluorescence. TGF-beta1 levels were quantified through ELISA. Both
PRP and PPP stimulated gingival fibroblasts-populated collagen gel contraction.
Moreover, Ilomastat and cytochalasin D inhibited this response. PRP and PPP
stimulated MT1-MMP and TIMP-2 production, RhoA activation and actin
cytoskeleton remodeling. Both formulations stimulated cell migration as
assessed through gingival tissue explants immersed within collagen gels,
nested cell migration assays and Transwell migration experiments. PRP and
PPP stimulated myofibroblastic differentiation determined through α-SMA, EDAFN,
type I collagen and periostin production. Although TGF-beta1 was more
concentrated in PRP when compared to PPP, the Smad pathway was similarly
activated by both formulations. The present study shows that soluble factors
derived from PRP and PPP may exert a similar cellular response compatible
with the promotion of wound remodeling in gingival fibroblasts. Moreover, our
results suggest that PPP may be studied as a useful therapeutic agent to
modulate gingival tissue healing.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/112047 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Cáceres Lluch, Mónica Andrea |
| Contributors | Smith Ferrer, Patricio Cristián, Martínez Winkler, Jorge, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Escuela de Graduados |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
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