Doctor en Ciencias Farmacéuticas / Las enfermedades cardiovasculares son, hoy en día, una de las principales causas de muerte.
Estas enfermedades generan comúnmente cambios en la estructura del corazón que conlleva a un
remodelamiento del tejido generando hipertrofia y fibrosis, lo cual altera la función cardiaca
normal y que finalmente se traduce en una insuficiencia cardiaca. La fibrosis cardiaca se genera
por un depósito excesivo de proteínas de la matriz extracelular (MEC) producto de la activación
de fibroblastos. Estas células, que representan alrededor del 70% del total de las células del
corazón humano, frente a una injuria cardiaca, responden a una variedad de citoquinas y factores
de crecimiento que promueven su diferenciación a miofibroblastos. Estos a su vez, expresan la
proteína α-actina del músculo liso (α-SMA) la que le confiere propiedades contráctiles y durante
el proceso de reparación del tejido cardiaco, son los principales responsables de la síntesis de
numerosas proteínas de la MEC, las que incluyen colágeno, fibronectina y laminina lo que
finalmente se traduce en el cierre de la herida. Asimismo, los miofibroblastos están encargados
de liberar citoquinas, factores de crecimiento, como angiotensina II, y en forma adicional,
incrementan el número de receptores para estos mismos mediadores.
Por otro lado, existen numerosos antecedentes que demuestran que la activación de la vía de
transducción del 3’,5’-adenosina monofosfato cíclico (AMPc) podría estar contribuyendo a la
reducción de la fibrosis cardiaca, ya que se ha visto que un incremento en los niveles de AMPc
en el fibroblasto cardiaco, puede disminuir su función celular así como también inhibir la
diferenciación de fibroblasto a miofibroblasto. En este sentido, durante mucho tiempo se ha
establecido como regla general que los efectos mediados por el AMPc en las células eucariontes
ocurría exclusivamente a través de la activación de la proteína quinasa A (PKA) y que a su vez
la PKA mediaba los cambios en la expresión y función de las proteínas. Sin embargo, el
descubrimiento de otra proteína llamada EPAC (del acrónimo exchange protein activated
directly by cAMP), que regula la actividad de las proteínas G pequeñas Rap 1 y Rap 2, y que
también es activada por el AMPc, comenzó a cambiar el campo de investigación relacionado con
el estudio de la vía de transducción de este segundo mensajero. A pesar de que los fibroblastos
cardiacos expresan EPAC-1, poco se conoce acerca de los mecanismos que regulan la expresión
de las isoformas de EPAC en los fibroblastos y miofibroblastos, y de que factores (péptidos, citoquinas, hormonas, entre otros) son los que están involucrados en la regulación de la misma.
Estudios han demostrado que los niveles de expresión de EPAC-1 se encuentran aumentados en
ratones con hipertrofia cardiaca y que la vía AMPc-EPAC1-Rap1 se encuentra activa bajo estas
circunstancias. Estos antecedentes estarían dando cuenta de que EPAC-1 podría estar
participando de forma activa en procesos asociados al remodelamiento cardiaco. Paralelamente,
se ha observado que el factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β1), citoquina
estrechamente relacionada con el proceso de fibrosis cardiaca, promueve la disminución de la
expresión de EPAC-1 en el fibroblasto cardiaco de rata adulta. Sin embargo, se desconoce el
mecanismo por el cual TGF-β1 regula la expresión de EPAC-1 tanto en el fibroblasto como en
los miofibroblastos cardiacos.
Desde el punto de vista de la funcionalidad de EPAC-1, existen algunos estudios que
demuestran la participación de esta proteína en algunos procesos celulares asociados al
remodelamiento cardiaco, tales como la migración de fibroblastos y secreción de colágeno, pero
se desconoce totalmente su participación en los mecanismos asociados a adhesión y contracción
de geles de colágeno, procesos celulares importantes en el remodelamiento del miocardio, en
donde participan activamente tanto fibroblastos como miofibroblastos.
Bajo este contexto, en la presente tesis, se estudió en una primera instancia cómo el TGF-β1
era capaz de regular los niveles de EPAC-1 tanto en fibroblastos como en miofibroblastos de
rata neonata. Para ello se realizaron estudios mediante westernblot con el fin de determinar los
niveles basales de EPAC-1 en nuestro modelo de estudio, para luego estudiar la influencia del
TGF- β1 sobre estos niveles a través de la intervención de sus vías de señalización canónica
(Smad2/3) y no canónica (MAPK y Akt). Los resultados obtenidos dieron cuenta de que los
miofibroblastos poseían mayores niveles de EPAC-1 comparado a los fibroblastos y que en la
regulación de EPAC- 1 en fibroblastos cardiacos participaron proteínas tales como Smad-2 y
JNK, mientras que en el miofibroblasto ambas vías de señalización, canónica y no canónica,
participaron de la regulación de los niveles de EPAC-1. Posteriormente y con el fin de dilucidar
el rol que juega este factor intercambiador de nucleótidos de guanina sobre las funciones de
fibroblastos y miofibroblastos, se evaluó la capacidad de EPAC-1 de fosforilar a su efector río
abajo Rap-1, utilizando para ello un análogo del AMPc con capacidad de activar selectivamente
a EPAC-1. Los resultados demostraron que en ambos fenotipos celulares EPAC-1 fue capaz de activar a su efector río abajo Rap-1, y más aún, que en los miofibroblastos está activación era
mucho mayor en comparación a sus precursores los fibroblastos.
Finalmente y con el objetivo de dilucidar la participación de EPAC-1 en procesos asociados
al remodelamiento cardiaco tales como adhesión, migración, contracción de geles de colágeno y
expresión de colágeno; se llevaron a cabo una serie de experimentos destinados a evaluar los
procesos antes mencionados en nuestro modelo de estudio. Para ello se utilizaron herramientas
mediante las cuales fue posible dilucidar los efectos mediados principalmente por EPAC-1 y a la
vez los efectos mediados por PKA, ya que al ser ambas proteínas efectoras del AMPc, era
importante poder establecer la contribución real de cada una de ellas a los procesos antes
señalados. Los resultados obtenidos sugieren que EPAC-1 participaría aumentando la adhesión
de fibroblastos y miofibroblastos a fibronectina, promoviendo la migración de fibroblastos,
aumentando la contracción de geles de colágeno tanto en fibroblastos como en miofibroblastos y
disminuyendo los niveles de colágeno en ambos fenotipos celulares. Estos resultados se
complementan con los obtenidos en relación a la PKA, en donde se logró dilucidar que esta
proteína estaría participando en los procesos de contracción de geles de colágeno y expresión de
colágeno. PKA al parecer aumentaría la contracción de geles de colágeno en miofibroblastos y
además, sería capaz de disminuir la expresión de colágeno tanto en fibroblastos como en
miofibroblastos.
En resumen, los resultados de la presente tesis sugieren por un lado que, el TGF- β1
regularía diferencialmente los niveles de EPAC-1 en fibroblastos y miofibroblastos cardiacos y
por otro lado, que EPAC-1 estaría regulando importantes funciones asociadas al remodelamiento
cardiaco tales como adhesión, migración, contracción de geles de colágeno y expresión de
colágeno en ambos fenotipos celulares. / Throughout the last decades cardiovascular diseases has become one of the most important
causes of death. These diseases commonly generate changes in the structure of the heart which
leads to tissue remodeling and fibrosis, which alters the normal cardiac function and eventually
resulting in cardiac failure. Cardiac fibrosis is generated by excessive deposition of extracellular
matrix proteins (ECM) produced by the activation of fibroblasts. These cells represent about
70% of total human heart cells and following a cardiac injury, they respond to a wide range of
cytokines and growth factors promoting their differentiation into myofibroblasts. These
myofibroblasts express the protein α-smooth muscle actin (α-SMA) synonymous with increased
contractile force. Enhanced contractility that attends this protein’s expression is believed to be
important in allowing these cells to contract during the wound healing in the damaged heart.
Myofibroblasts are the primary mediators responsible for synthesis of many ECM proteins,
including collagen, fibronectin and laminin, among others. During transition of fibroblast into
myofibroblasts they acquire the capability to be avid producers of cytokines and growth factors,
and in addition, increase the receptor number for the same mediators.
A growing body of literature over the last years has made evident that activation of the
transduction pathway of 3', 5'-cyclic adenosine monophosphate (cAMP) may be contributing to
the reduction of cardiac fibrosis. It has been demonstrated that an increase in cAMP levels in
cardiac fibroblasts can reduce their cellular function as well as inhibit fibroblast differentiation
into myofibroblasts. In this regard, it has become generally accepted, that the effects mediated
by cAMP in eukaryotic cells occurred only by activation of protein kinase A (PKA) which once
activated was able to mediate expression and protein function. However, the discovery of
another protein, called EPAC (exchange protein activated directly by cAMP), which regulates
the activity of small G proteins Rap 1 and 2, has begun to innovate the research field of the
cAMP transduction pathway.
It is known that cardiac fibroblast express EPAC-1, however little is known about the
mechanism regulating the expression of this protein in fibroblast and myofibroblasts. In this
regard, studies in this area have demonstrated that levels of EPAC-1 expression were increased
in mice with cardiac hypertrophy and cAMP pathway EPAC1-Rap1 was very active. These results support the idea that EPAC-1 could be actively involved in processes associated with
cardiac remodeling. In parallel, it has been observed that the transforming growth factor β1
(TGF-β1), cytokine closely related to the process of cardiac fibrosis, promotes the decrease of
EPAC-1 expression in cardiac fibroblasts. However, the mechanism by which TGF-β1 regulates
fibroblasts and myofibroblasts EPAC-1 expression still remains unclear.
There are few studies demonstrating the involvement of EPAC-1 in cellular processes
associated with cardiac remodeling. There are some investigations related to fibroblast migration
and collagen secretion, nevertheless EPAC-1 participation in processes associated to cardiac
remodeling such as cellular adhesion and those related to capability to contract collagen gels
matrix are completely unknown.
In this context, we studied EPAC-1 levels and the effect caused by TGF-β1 on EPAC-1
expression in both cardiac fibroblasts and myofibroblasts through the intervention of TGF-β1
canonical (Smad) and no canonical (MAPK and Akt) signaling pathways. The data obtained
showed that cardiac myofibroblasts have greater amounts of EPAC-1 than cardiac fibroblasts. In
the presence of chemical inhibitors the results showed that fibroblast EPAC-1 expression is
regulated by JNK-MAPK and Smad2 protein, and the myofibroblast EPAC-1 expression is
regulated by both signaling pathways (Smad, MAPKs and Akt). Subsequently, in order to
determine the EPAC-1 capability to activate its downstream effector Rap1, we stimulated this
protein using a cAMP analog able to specifically activate EPAC-1. The results showed that
EPAC-1 was able to phosphorylate its downstream effector Rap-1 in both fibroblast and
myofibroblasts, however myofibroblasts demonstrated to have higher levels of Rap1-GTP
compared to cardiac fibroblasts.
Finally and in order to elucidate the EPAC-1 involvement in cardiac remodeling, we
performed a series of experiments designed to evaluate cellular adhesion, migration, collagen gel
contraction and collagen expression. To evaluate these functions we used selective molecules
ables to recognize specifically both EPAC-1 and PKA. The results suggest that EPA-1 increases
fibroblast and myofibroblast fibronectin adhesion, promotes fibroblasts migration, enhances
collagen gel contraction in both fibroblast and myofibroblast and decrease collagen levels
measured by western blot. On the other hand, the results obtained using a PKA agonist suggest that this protein apparently increases myofibroblasts collagen gel contraction and reduces
collagen expression measured by western blot in both fibroblast and myofibroblasts.
In summary, the results obtained in this thesis suggest TGF-β1 participation in regulating
differentially EPAC-1 levels in cardiac fibroblasts and myofibroblasts and EPAC-1 participation
in cellular processes related to adhesion, migration, collagen gel contraction and collagen
expression; all of them important cellular processes involved in cardiac remodeling in both
fibroblast and myofibroblasts. / Fondecyt
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/113459 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Olmedo Alegría, Ivonne Odette |
| Contributors | Díaz Araya, Guillermo, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
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