Memoria para optar al Título Profesional de Bioquímico / Autorizada por el autor, pero con restricción para ser publicada a texto completo en el Portal de Tesis Electrónicas, hasta diciembre de 2014 / Salmonella enterica es un patógeno intracelular Gram negativo capaz de infectar un amplio rango de hospederos. En particular, S. enterica serovar Gallinarum infecta aves de corral causando una enfermedad sistémica que puede provocar la muerte. Una vez que entra al organismo, Salmonella utiliza una serie de factores de virulencia que le permiten sobrevivir al pH ácido del estómago, resistir a sales biliares y péptidos antimicrobiales, invadir y traspasar la barrera epitelial intestinal, sobrevivir y replicarse dentro de macrófagos y diseminarse dentro de los órganos del hospedero, principalmente a nivel del bazo e hígado.
Hasta el momento, se desconoce gran parte de los factores de virulencia que utiliza S. Gallinarum para infectar un hospedero. Es por eso que en este trabajo se propuso identificar los genes de S. Gallinarum involucrados en la colonización sistémica en un modelo murino a través de un análisis global de mutantes bajo selección negativa in vivo. Para ello, se utilizó una genoteca de ~48.000 mutantes por inserción del transposón EZ-Tn5<T7/KAN-2>, la que se inyectó en ratones BALB/c por vía intraperitoneal. La comparación entre la población de bacterias inyectadas (input) y la población de bacterias recuperadas a partir del bazo de los animales (output) mediante hibridaciones competitivas en un microarray genómico nos permitió obtener una base de datos en la que identificamos 280 mutantes bajo selección negativa in vivo.
La lista de mutantes bajo selección negativa incluye genes descritos previamente como necesarios para la virulencia de S. enterica, como los sistemas de secreción tipo III codificados en la SPI-1 y SPI-2, genes que codifican efectores de estos sistemas (sseB, sseE), genes relacionados a la síntesis y modificación del LPS (rfaL, rfaJ, rfbK, rfbM), genes que codifican reguladores globales de la virulencia (phoP, phoQ, ompR, envZ), genes que codifican proteínas de respuesta a estrés (oxyR, rpoE, htrA), entre otros. La lista también incluye genes no reportados previamente como necesarios para la virulencia de S. Gallinarum, pero si para la virulencia de otros serovares de S. enterica, como tatB y tatC que codifican proteínas del sistema Twin-Arginine Transport; y genes con funciones desconocidas como la región génica STM3118 a STM3121 perteneciente a la SPI-13.
El sistema Twin-Arginine Transport es un sistema que transporta proteínas plegadas hacia el periplasma de bacterias Gram negativo. Por otra parte, aún se desconoce la función exacta de SPI-13, pero se ha visto que es necesaria para la replicación de S. Typhimurium dentro de macrófagos murinos. A través de ensayos de competencia y complementación in vivo entre la cepa silvestre y las mutantes ΔtatABC o ΔSPI-13, se confirmó la participación de estas regiones génicas en la colonización sistémica de ratones BALB/c.
Cabe destacar que la lista de mutantes bajo selección negativa in vivo no incluye ciertos genes previamente descritos como necesarios para la virulencia de S. enterica, como el gen aroA que codifica una proteína involucrada en la síntesis de compuestos aromáticos. Se realizó un ensayo de competencia con una mutante ΔaroA y se determinó que presenta una colonización sistémica deficiente en ratones BALB/c, confirmando la participación de aroA en la virulencia de esta bacteria.
Finalmente, mediante este análisis global de mutantes bajo selección negativa in vivo logramos identificar genes de S. Gallinarum requeridos para la colonización sistémica eficiente de un hospedero murino, comprobando de forma independiente la participación del operón tatABC, la isla de patogenicidad SPI-13 y el gen aroA en este proceso. El análisis individual de los genes identificados en esta base de datos permitirá ampliar el conocimiento sobre los mecanismos de patogenicidad de S. Gallinarum / Salmonella is a Gram negative intracelular pathogen able to infect a broad range of hosts. Specifically, S. enterica serovar Gallinarum infects poultry leading to a systemic illness that may cause death. Once Salmonella enters the organism, it uses a variety of virulence factors which allows it to survive in the gastric acid, resist bile salts and antimicrobial peptides, invade and cross the intestinal epithelium, survive and grow within macrophages, and colonize internal organs of the host, mainly spleen and liver.
The main virulence factors that S. Gallinarum uses to infect a host remained unknown until know. In this work we proposed to identify genes involved in the systemic colonization of S. Gallinarum in the murine model through a genome-wide screening of mutants under negative selection in vivo. To accomplish this, we used a pool of ~48.000 mutants generated by random insertion of the EZ-Tn5<T7/KAN-2> transposon to inoculate BALB/c mice intraperitoneally. The comparison between the pool of inoculated bacteria (input) and the pool of bacteria recovered from the spleen of the animals (output) through high-throughput microarray-based screening of mutants allowed us to obtain a database of 280 mutants under negative selection in vivo.
Within this database we found mutants in several genes known to be required for Salmonella enterica virulence, like those related to the type III secretion system encoded in SPI-1 and SPI-2, genes encoding efectors secreted by these systems (sseB, sseE), genes related to LPS synthesis and modification (rfaL, rfaJ, rfbK, rfbM), genes encoding global virulence regulators (phoP, phoQ, ompR, envZ), and genes encoding proteins involved in response to stress (oxyR, rpoE, htrA), among others. We also found genes not previously reported as required for S. Gallinaum virulence, like tatB and tatC, encoding components of the Twin-Arginine Transport system; and genes with unknown function like the genetic region comprised by STM3118 to STM3121, belonging to SPI-13.
The Twin-Arginine Transport system transports a number of folded proteins to the periplasma of Gram-negative bacteria. Besides, the exact function of SPI-13 is still unknown, but has been seen that is necessary for the growth of S. Typhimurium inside murine macrophages. Through in vivo competition and complementation assays between wild type and ΔtatABC or ΔSPI-13 mutants, we were able to confirm the important role of these genes in the systemic colonization of BALB/c mice by S. Gallinarum.
Noteworthly, there were genes that we didn’t observe on our database that have been reported as required S. enterica virulence like aroA, a gene involved in the synthesis of aromatic coumpounds. Using an in vivo competition assay we observed a systemic colonization defect for the ΔaroA mutant in BALB/c mice, indicating that this gene is indeed required for S. Gallinarum virulence in this host.
Overall, our genome-wide screening of mutants under negative selection in vivo allowed us to identify 280 genes of S. Gallinarum required for the systemic colonization of a murine host. Also, we confirmed the role played by the tatABC operon, SPI-13 and aroA in the systemic colonization by this serovar. The in-depth analysis of the genes identified in our screening will expand our current knowledge on the mechanisms of S. Gallinarum pathogenesis / FONDECYT
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/115384 |
| Date | 12 1900 |
| Creators | Mardones Acuña, Paula Carolina |
| Contributors | Santiviago Cid, Carlos, Alvarez Armijo, Sergio Aníbal, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
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