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Identificación global de genes de Salmonella enterica serovar Gallinarum requeridos para la colonización sistémica de un hospedero murino

Mardones Acuña, Paula Carolina 12 1900 (has links)
Memoria para optar al Título Profesional de Bioquímico / Autorizada por el autor, pero con restricción para ser publicada a texto completo en el Portal de Tesis Electrónicas, hasta diciembre de 2014 / Salmonella enterica es un patógeno intracelular Gram negativo capaz de infectar un amplio rango de hospederos. En particular, S. enterica serovar Gallinarum infecta aves de corral causando una enfermedad sistémica que puede provocar la muerte. Una vez que entra al organismo, Salmonella utiliza una serie de factores de virulencia que le permiten sobrevivir al pH ácido del estómago, resistir a sales biliares y péptidos antimicrobiales, invadir y traspasar la barrera epitelial intestinal, sobrevivir y replicarse dentro de macrófagos y diseminarse dentro de los órganos del hospedero, principalmente a nivel del bazo e hígado. Hasta el momento, se desconoce gran parte de los factores de virulencia que utiliza S. Gallinarum para infectar un hospedero. Es por eso que en este trabajo se propuso identificar los genes de S. Gallinarum involucrados en la colonización sistémica en un modelo murino a través de un análisis global de mutantes bajo selección negativa in vivo. Para ello, se utilizó una genoteca de ~48.000 mutantes por inserción del transposón EZ-Tn5<T7/KAN-2>, la que se inyectó en ratones BALB/c por vía intraperitoneal. La comparación entre la población de bacterias inyectadas (input) y la población de bacterias recuperadas a partir del bazo de los animales (output) mediante hibridaciones competitivas en un microarray genómico nos permitió obtener una base de datos en la que identificamos 280 mutantes bajo selección negativa in vivo. La lista de mutantes bajo selección negativa incluye genes descritos previamente como necesarios para la virulencia de S. enterica, como los sistemas de secreción tipo III codificados en la SPI-1 y SPI-2, genes que codifican efectores de estos sistemas (sseB, sseE), genes relacionados a la síntesis y modificación del LPS (rfaL, rfaJ, rfbK, rfbM), genes que codifican reguladores globales de la virulencia (phoP, phoQ, ompR, envZ), genes que codifican proteínas de respuesta a estrés (oxyR, rpoE, htrA), entre otros. La lista también incluye genes no reportados previamente como necesarios para la virulencia de S. Gallinarum, pero si para la virulencia de otros serovares de S. enterica, como tatB y tatC que codifican proteínas del sistema Twin-Arginine Transport; y genes con funciones desconocidas como la región génica STM3118 a STM3121 perteneciente a la SPI-13. El sistema Twin-Arginine Transport es un sistema que transporta proteínas plegadas hacia el periplasma de bacterias Gram negativo. Por otra parte, aún se desconoce la función exacta de SPI-13, pero se ha visto que es necesaria para la replicación de S. Typhimurium dentro de macrófagos murinos. A través de ensayos de competencia y complementación in vivo entre la cepa silvestre y las mutantes ΔtatABC o ΔSPI-13, se confirmó la participación de estas regiones génicas en la colonización sistémica de ratones BALB/c. Cabe destacar que la lista de mutantes bajo selección negativa in vivo no incluye ciertos genes previamente descritos como necesarios para la virulencia de S. enterica, como el gen aroA que codifica una proteína involucrada en la síntesis de compuestos aromáticos. Se realizó un ensayo de competencia con una mutante ΔaroA y se determinó que presenta una colonización sistémica deficiente en ratones BALB/c, confirmando la participación de aroA en la virulencia de esta bacteria. Finalmente, mediante este análisis global de mutantes bajo selección negativa in vivo logramos identificar genes de S. Gallinarum requeridos para la colonización sistémica eficiente de un hospedero murino, comprobando de forma independiente la participación del operón tatABC, la isla de patogenicidad SPI-13 y el gen aroA en este proceso. El análisis individual de los genes identificados en esta base de datos permitirá ampliar el conocimiento sobre los mecanismos de patogenicidad de S. Gallinarum / Salmonella is a Gram negative intracelular pathogen able to infect a broad range of hosts. Specifically, S. enterica serovar Gallinarum infects poultry leading to a systemic illness that may cause death. Once Salmonella enters the organism, it uses a variety of virulence factors which allows it to survive in the gastric acid, resist bile salts and antimicrobial peptides, invade and cross the intestinal epithelium, survive and grow within macrophages, and colonize internal organs of the host, mainly spleen and liver. The main virulence factors that S. Gallinarum uses to infect a host remained unknown until know. In this work we proposed to identify genes involved in the systemic colonization of S. Gallinarum in the murine model through a genome-wide screening of mutants under negative selection in vivo. To accomplish this, we used a pool of ~48.000 mutants generated by random insertion of the EZ-Tn5<T7/KAN-2> transposon to inoculate BALB/c mice intraperitoneally. The comparison between the pool of inoculated bacteria (input) and the pool of bacteria recovered from the spleen of the animals (output) through high-throughput microarray-based screening of mutants allowed us to obtain a database of 280 mutants under negative selection in vivo. Within this database we found mutants in several genes known to be required for Salmonella enterica virulence, like those related to the type III secretion system encoded in SPI-1 and SPI-2, genes encoding efectors secreted by these systems (sseB, sseE), genes related to LPS synthesis and modification (rfaL, rfaJ, rfbK, rfbM), genes encoding global virulence regulators (phoP, phoQ, ompR, envZ), and genes encoding proteins involved in response to stress (oxyR, rpoE, htrA), among others. We also found genes not previously reported as required for S. Gallinaum virulence, like tatB and tatC, encoding components of the Twin-Arginine Transport system; and genes with unknown function like the genetic region comprised by STM3118 to STM3121, belonging to SPI-13. The Twin-Arginine Transport system transports a number of folded proteins to the periplasma of Gram-negative bacteria. Besides, the exact function of SPI-13 is still unknown, but has been seen that is necessary for the growth of S. Typhimurium inside murine macrophages. Through in vivo competition and complementation assays between wild type and ΔtatABC or ΔSPI-13 mutants, we were able to confirm the important role of these genes in the systemic colonization of BALB/c mice by S. Gallinarum. Noteworthly, there were genes that we didn’t observe on our database that have been reported as required S. enterica virulence like aroA, a gene involved in the synthesis of aromatic coumpounds. Using an in vivo competition assay we observed a systemic colonization defect for the ΔaroA mutant in BALB/c mice, indicating that this gene is indeed required for S. Gallinarum virulence in this host. Overall, our genome-wide screening of mutants under negative selection in vivo allowed us to identify 280 genes of S. Gallinarum required for the systemic colonization of a murine host. Also, we confirmed the role played by the tatABC operon, SPI-13 and aroA in the systemic colonization by this serovar. The in-depth analysis of the genes identified in our screening will expand our current knowledge on the mechanisms of S. Gallinarum pathogenesis / FONDECYT
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Evaluación del uso combinado de exclusión competitiva y vacunación en la prevención de infecciones producidas por Salmonella gallinarum en gallinas de postura

Cruz Ramírez, Paola Teresa January 2004 (has links)
Se evaluó el efecto protectivo del uso combinado de exclusión competitiva (EC) y vacunación en gallinas de postura desafiadas experimentalmente con una cepa de campo de S.gallinarum. En dos ensayos se emplearon 200 pollitas de postura de la línea Hyline Brown de 1 día de edad provenientes de aves reproductoras libres de Salmonella sp. Para cada ensayo las aves fueron distribuídas en cinco grupos de 20 aves cada uno. En el primer ensayo, 100 aves fueron desafiadas a las 18 semanas de edad con 1 x 109 UFC/ ml de S. gallinarum y en el segundo ensayo con 1 x 10 8 UFC/ ml de la misma cepa a las 28 semanas de edad Los grupos A y C recibieron tres aplicaciones de una vacuna conteniendo la cepa 9R de S. gallinarum (Vacuna 9R) a la 4ta, 8va y 10ma semana de edad, mientras que los grupos B y D recibieron una aplicación de una vacuna inactivada de S. enteritidis en emulsión oleosa (Bacterina) a la 13va semana de edad. Adicionalmente los grupos A y B recibieron un producto de EC al día de edad en planta de incubación. En cada ensayo un grupo de aves que no recibió ninguna protección fue usado como control. El experimento se inició con la crianza de las aves en una granja comercial al norte de Lima bajo condiciones normales de manejo y bioseguridad. Las aves fueron trasladadas a la unidad experimental del Laboratorio de Patología Aviar de la FMV-UNMSM para el desafío y evaluación clínica por un periodo de observación de 22 días post reto. Fueron evaluados signos clínicos, mortalidad, lesiones, respuesta serológica y recuperación de la cepa de desafío. Para el análisis estadístico se usó la curva de supervivencia de Kaplan Meier y las diferencias estadísticas fueron evaluadas por Regresión de Cox. En ambos ensayos la mejor protección fue obtenida en los grupos vacunados con vacuna 9R sola o combinada con Exclusión competitiva (p<0.05). Diferencias estadísticas fueron observadas entre el grupo control y grupo A (vacuna 9R más EC) y grupo C (vacuna 9R). En ambos ensayos los grupos vacunados con bacterina sola o combinada con EC no fueron protegidos, no existiendo diferencias estadísticas con el grupo control (p>0.05). En el primer y segundo ensayo las aves del grupo A tuvieron una media de supervivencia significativamente diferente comparada con el grupo control y los grupos con bacterina y EC más bacterina (p<0.05). / The protective effect of the combined use of vaccination and competitive exclusion (CE) in layer hens experimentally challenged with a S. gallinarum field strain was evaluated. Two hundred Hyline Brown pullets since one day old and obtained from salmonella- free breeders were used. We divided this study in two trials in order to do two challenges in two different ages. Half of the birds were challenged at 18 weeks old (Trial 1) with 1 x 109 UFC/ ml de S. gallinarum and half remained were challenged at 25 weeks old (Trial 2) with 1 x 108 UFC/ ml . The birds were divided in five groups of 20 birds each. The groups A and C received three applications of a live Salmonella gallinarum 9R strain vaccine (9R vaccine) at 4th , 8th and 10th weeks old subcutaneously. Groups B and D received a Salmonella enteritidis oil emulsion commercial bacterine (bacterine SE) at 13 weeks old, subcutaneously. Group E unvaccinated and without competitive exclusion was the control group. The study started with the birds breed in a commercial poultry farm at the north of Lima under normal management and bio security conditions .The birds were moved to the Avian Pathology Laboratory of the College of Veterinary Medicine, San Marcos University to challenge and clinic evaluation about 22 days post-challenge. Clinical signs, mortality rates, lesions, serologic response and field strain recovery were evaluated. Kaplan Meier design and Cox regression were used to determine statistical differences. In both trials the best protection was performed in 9R vaccine groups single or combined with CE. (p<0.05). Statistical differences were observed between the control group and group A (9R vaccine plus CE) and group C (9R vaccine) .In both trials the bacterine SE vaccinated groups were not protected and there were no differences with the control group (p>0.05). In trial 1 and 2 the group A had a higher survival mean than the control group and bacterine SE group and bacterine plus CE (p<0.05).
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Evaluación del uso combinado de exclusión competitiva y vacunación en la prevención de infecciones producidas por Salmonella gallinarum en gallinas de postura

Cruz Ramírez, Paola Teresa January 2004 (has links)
Se evaluó el efecto protectivo del uso combinado de exclusión competitiva (EC) y vacunación en gallinas de postura desafiadas experimentalmente con una cepa de campo de S.gallinarum. En dos ensayos se emplearon 200 pollitas de postura de la línea Hyline Brown de 1 día de edad provenientes de aves reproductoras libres de Salmonella sp. Para cada ensayo las aves fueron distribuídas en cinco grupos de 20 aves cada uno. En el primer ensayo, 100 aves fueron desafiadas a las 18 semanas de edad con 1 x 109 UFC/ ml de S. gallinarum y en el segundo ensayo con 1 x 10 8 UFC/ ml de la misma cepa a las 28 semanas de edad Los grupos A y C recibieron tres aplicaciones de una vacuna conteniendo la cepa 9R de S. gallinarum (Vacuna 9R) a la 4ta, 8va y 10ma semana de edad, mientras que los grupos B y D recibieron una aplicación de una vacuna inactivada de S. enteritidis en emulsión oleosa (Bacterina) a la 13va semana de edad. Adicionalmente los grupos A y B recibieron un producto de EC al día de edad en planta de incubación. En cada ensayo un grupo de aves que no recibió ninguna protección fue usado como control. El experimento se inició con la crianza de las aves en una granja comercial al norte de Lima bajo condiciones normales de manejo y bioseguridad. Las aves fueron trasladadas a la unidad experimental del Laboratorio de Patología Aviar de la FMV-UNMSM para el desafío y evaluación clínica por un periodo de observación de 22 días post reto. Fueron evaluados signos clínicos, mortalidad, lesiones, respuesta serológica y recuperación de la cepa de desafío. Para el análisis estadístico se usó la curva de supervivencia de Kaplan Meier y las diferencias estadísticas fueron evaluadas por Regresión de Cox. En ambos ensayos la mejor protección fue obtenida en los grupos vacunados con vacuna 9R sola o combinada con Exclusión competitiva (p<0.05). Diferencias estadísticas fueron observadas entre el grupo control y grupo A (vacuna 9R más EC) y grupo C (vacuna 9R). En ambos ensayos los grupos vacunados con bacterina sola o combinada con EC no fueron protegidos, no existiendo diferencias estadísticas con el grupo control (p>0.05). En el primer y segundo ensayo las aves del grupo A tuvieron una media de supervivencia significativamente diferente comparada con el grupo control y los grupos con bacterina y EC más bacterina (p<0.05). / The protective effect of the combined use of vaccination and competitive exclusion (CE) in layer hens experimentally challenged with a S. gallinarum field strain was evaluated. Two hundred Hyline Brown pullets since one day old and obtained from salmonella- free breeders were used. We divided this study in two trials in order to do two challenges in two different ages. Half of the birds were challenged at 18 weeks old (Trial 1) with 1 x 109 UFC/ ml de S. gallinarum and half remained were challenged at 25 weeks old (Trial 2) with 1 x 108 UFC/ ml . The birds were divided in five groups of 20 birds each. The groups A and C received three applications of a live Salmonella gallinarum 9R strain vaccine (9R vaccine) at 4th , 8th and 10th weeks old subcutaneously. Groups B and D received a Salmonella enteritidis oil emulsion commercial bacterine (bacterine SE) at 13 weeks old, subcutaneously. Group E unvaccinated and without competitive exclusion was the control group. The study started with the birds breed in a commercial poultry farm at the north of Lima under normal management and bio security conditions .The birds were moved to the Avian Pathology Laboratory of the College of Veterinary Medicine, San Marcos University to challenge and clinic evaluation about 22 days post-challenge. Clinical signs, mortality rates, lesions, serologic response and field strain recovery were evaluated. Kaplan Meier design and Cox regression were used to determine statistical differences. In both trials the best protection was performed in 9R vaccine groups single or combined with CE. (p<0.05). Statistical differences were observed between the control group and group A (9R vaccine plus CE) and group C (9R vaccine) .In both trials the bacterine SE vaccinated groups were not protected and there were no differences with the control group (p>0.05). In trial 1 and 2 the group A had a higher survival mean than the control group and bacterine SE group and bacterine plus CE (p<0.05). / Tesis
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Characterization of the type VI protein secretion system encoded in the Salmonella pathogenicity island 19 and its role in the pathogenicity of serotypes Gallinarum and Enteritidis

Blondel Buijuy, Carlos José January 2011 (has links)
Thesis Submitted in Partial Fulfillment for the Requirements to achieve the Degree of PhD in Biochemistry / El genero Salmonella comprende a mas 2,500 serotipos conocidos distribuidos en dos especies: enterica y bongori. Estos serotipos difieren mucho en términos de patogenicidad y especificidad hospedero. Dos serotipos de Salmonella entérica son de especial relevancia: los serotipos Gallinarum y Enteritidis. S. Gallinarum presenta un rango hospedero restringido a aves y causa una severa enfermedad sistémica conocida como tifoidea aviar, la que causa grandes perdidas económicas en la producción aviar en distintas partes del mundo. S. Enteritidis, en cambio, infecta a un amplio rango de hospederos incluyendo humanos, ratones y aves. A diferencia de S. Gallinarum, S. Enteritidis genera una infección subclinica en los pollos, y las aves infectadas pueden convertirse en portadores crónicos, poniendo huevos contaminados por Salmonella. El consumo humano de productos aviares o huevos resulta en un cuadro de gastroenteritis aguda autolimitante, la cual es responsable por ~61% del 1.5 millones de casos de salmonelosis reportados entre los años 1995 y 2008 (WHO Global Foodborne Infections Network Country Databank). Existen pocos trabajos realizados sobre los mecanismos moleculares detrás de la adaptación al hospedero aviar y sobre las implicancias clínicas de las infecciones causadas por los serotipos Enteritidis y Gallinarum, sin embargo evidencia reciente sugiere que estos serotipos poseen factores de virulencia no descritos que pueden ser responsables de estas diferencias. La interación entre las bacterias y sus hospederos es guiada por una comunicación dinámica que busca influenciar la respuesta del hospedero. Dentro de las herramientas utilizadas por las bacterias para influir la respuesta de sus hospederos, las maquinas secretoras que entregan proteínas y toxinas hacia el ambiente intracelular de sus blancos eucariontes son cruciales para la supervivencia y virulencia bacteriana. El Sistema de Secreción Tipo VI (T6SS) es un nuevo mecanismo de translocación de proteínas que existe en la mayoría de bacterias Gram-negativo que se encuentran en contacto íntimo con células eucariontes, incluyendo a aquellas que son patógenos humanos y de plantas. El papel preciso que cumplen estos T6SS todavía es desconocido pero es claro que cumple un papel importante en la virulencia bacteriana. En Salmonella enterica, solo se ha descrito un T6SS el cual esta codificado en la Isla de Patogenicidad 6 de Salmonella (SPI-6). En esta tesis, a través de análisis bioinformaticos y de genomica comparativa se determinó que el genero Salmonella codifica 5 T6SS, distribuidos diferencialmente entre distintos serotipos y con historias evolutivas diferentes. Los nuevos T6SS fueron identificados en islas genómicas designadas SPI-19, SPI-20, SPI-21 and SPI-22. Ademas de la identificación de estas islas, una nueva proteína VgrG “evolucionada” con un dominio del tipo S-Piocina fue identificado en SPI-21. La presencia de este dominio sugirió por primera vez un papel de los T6SS en muerte bacteriana, abriendo un nuevo capitulo en el estudio de T6SS y su papel en relaciones interbacterianas. El T6SS de SPI-19 fue de especial relevancia debido a su amplia distribución dentro de serotipos virulentos de Salmonella y porque análisis bioinformaticos mostraron que mientras Gallinarum codifica un T6SS completo, el serotipo Enteritidis solo codifica para remanentes de este sistema. A pesar de estar estrechamente relacionados, los serotipos Gallinarum y Enteritidis presentan diferencias profundas en su rango de hospederos y patogenicidad. Por lo tanto, es posible especular que la presencia de un T6SS activo esta relacionada de alguna manera con las diferencias en especificidad hospedero y patogenicidad presentada por estos dos serotipos. Para resolver esta hipótesis y determinar la contribución de SPI-19 a la patogenicidad de Salmonella, el objetivo de esta tesis fue determinar si la isla genomica SPI-19 codifica un T6SS funcional que contribuye a la patogenicidad de Gallinarum y Enteritidis en el hospedero aviar. De manera de caracterizar el T6SS de SPI-19, fusiones génicas y de operon fueron construidas y la expresión, producción y secreción de componentes del T6SS fueron evaluadas bajo diferentes condiciones de crecimiento in vitro. El análisis mostro que la mayoría de los componentes se mantienen reprimidos bajo las condiciones analizadas. Infección de macrófagos murinos con una cepa de Gallinarum con una fusión entre el componente estructural/secretado VgrG al reportero GFP, mostró que los componentes del T6SS son preferencialmente producidos al interior de células infectadas. Mutantes por deleción no polares de la isla SPI-19 y componentes específicos del T6SS reveló que este T6SS es necesario para la supervivencia de Salmonella Gallinarum al interior de macrófagos a tiempos tardios de infección. Sin embargo, el T6SS de SPI-19 no pudo ser asociado muerte celular o citotoxicidad de macrófagos inducida por Salmonella. Para determinar la contribución del T6SS de SPI-19 a la patogenicidad de Salmonella, mutantes del T6SS fueron analizadas en ensayos de competencia contra la cepa silvestre de Gallinarum. Infección oral de pollos White Leghorn de cuatro días de edad, reveló que las mutantes del T6SS colonizaron pobremente el ileo, ciego, hígado y bazo comparado a la cepa silvestre. Restitución de SPI-19 a la mutante SPI- 19, utilizando el sistema VEX-Capture, complementó este defecto en colonización. Para analizar el impacto de poseer un T6SS completo en la habilidad de S. Enteritidis para colonizar al hospedero aviar, la SPI-19 de Gallinarum fue transferida a Enteritidis. Experimentos in vivo mostraron que la presencia de una SPI-19 completa aumento significatvamente la habilidad de Enteritidis para colonizar el ileo, hígado y bazo de pollos infectados al dia 1 post-infección. Sin embargo, esa ventaja en la colonización no fue duradera ya que esta cepa mostró un fuerte defecto en la colonización desde el día 3 post-infección hasta el final de los experimentos. Estos resultados sugieren que transferencia de SPI-19 desde S. Gallinarum tiene un impacto negativo en la habilidad de S. Enteritidis para colonizar el hospedero aviar. De esta forma podemos especular que perdida del T6SS de SPI-19 corresponde a un evento patoadaptativo durante la evolución de S. Enteritidis. Del mismo modo, este es el primer trabajo en el que se utiliza el método VEX-Capture para determinar el efecto de la transferencia de islas genómicas en un modelo animal de infección bacteriana. El reciente descubrimiento de Sistemas de Secreción Tipo VI (T6SS) ha abierto un nuevo capitulo en el estudio de la adaptación de Salmonella hacia sus hospederos y el medio ambiente. Si Salmonella codifica T6SS y si aquellos pueden ser considerados eventos evolutivos cuanticos, fueron algunas de las preguntas que el descubrimiento de los T6SS en los genomas bacterianos generó. En esta tesis, hemos expandido el actual conocimiento sobre los T6SS bacterianos y el potencial patogénico de Salmonella mediante: i) la identificación y descripción de 4 nuevas Islas de Patogenicidad de Salmonella (SPI-19, SPI-20, SPI-21 and SPI-22) que codifican para T6SS filogenéticamente distintos, ii) el descubrimiento de una nueva “VgrG” evolucionada que sugirió por primera vez un papel de los T6SS en relaciones interbacterianas, iii) identificando que el T6SS de SPI-19 contribuye a la supervivencia intracelular de Salmonella en macrófagos y iv) determinando que el T6SS de SPI-19 contribuye a la colonización de pollos por S. Gallinarum. / The Salmonella genus includes over 2,500 known serotypes distributed between the two species: enterica and bongori. These serotypes differ greatly in terms of pathogenicity and host specificity. Two Salmonella enterica serotypes are of significant relevance: serotypes Gallinarum and Enteritidis. S. Gallinarum has a host range restricted to birds and causes a severe systemic disease called fowl typhoid, which causes major economic losses in poultry production in several parts of the world. S. Enteritidis on the other hand, infects a broad range of hosts including humans, mice and avian species. In contrast to S. Gallinarum, S. Enteritidis generates a subclinical infection in poultry, and infected hens can become chronic carriers laying Salmonella contaminated eggs. Human consumption of contaminated poultry or egg products results in an acute self-limiting gastroenteritis, being responsible for ~61% of the estimated 1.5 million human salmonellosis cases reported between 1995 and 2008 (WHO Global Foodborne Infections Network Country Databank). There is little work done on the molecular mechanisms behind the differential host-adaptation and clinical outcomes of infections caused by serotypes Enteritidis and Gallinarum in their susceptible hosts, including birds, but recent evidence suggests that these serotypes might possess undescribed virulence factors that may account for these differences. Interaction between bacteria and hosts is guided by a communication/signaling interplay which aims to influence the host response. Among the tools used by bacteria to influence the host response, secretion machines that deliver proteins and toxins into the environment and within eukaryotic target cells are crucial for bacterial virulence and survival. The Type VI Secretion System (T6SS) is a newly described mechanism for protein translocation that exists in most Gram-negative bacteria that come into close contact with eukaryotic cells, including plant and animal pathogens. The precise role and mode of action of T6SS is still unknown, but it is clear that plays an important role in bacterial virulence. In Salmonella enterica, only one T6SS encoded in Salmonella Pathogenicity Island 6 (SPI-6) has been described. In this thesis, through bioinformatics and comparative genomic analyzes it was determined that the genus Salmonella encodes 5 T6SS loci, differentially distributed among different serotypes and with distinct phylogenetic histories. The novel T6SS loci were identified in genomic islands designated SPI-19, SPI-20, SPI-21 and SPI-22. In addition of the identification of these T6SS loci, a novel “evolved” VgrG protein with a S-Type Pyocin containing-domain, was identified in SPI-21. The presence of this protein domain suggested for the first time a role for T6SSs in bacterial killing opening a new chapter in the study of T6SS and its role in inter-bacterial relationships. The SPI-19 T6SS was of significant relevance due to its wide distribution among virulent Salmonella serotypes and because bioinformatics analyzes showed that while Gallinarum encodes a complete T6SS, serotype Enteritidis only encodes for remnants of this system. Despite being closely related, serotypes Gallinarum and Enteritidis present profound differences in their host-range and pathogenicity. Therefore, it is tempting to speculate that the presence of an active T6SS is somehow related to the host-adaptation and pathogenicity differences presented by these serotypes. To resolve this hypothesis and assess the contribution of SPI-19 to Salmonella pathogenicity, the objective of this thesis was to determine whether the SPI-19 genomic island encodes a functional T6SS contributing to the pathogenicity of Gallinarum and Enteritidis in the avian host. In order to characterize the SPI-19 T6SS, gene and operon fusions were constructed and expression, production and secretion of T6SS components were evaluated under different in vitro growth conditions. The analysis showed that most T6SS components remain repressed under the conditions tested. Infection of murine macrophages with a Gallinarum strain harboring the structural/secreted T6SS component VgrG fused to the GFP reporter showed that T6SS components are preferentially produced inside infected cells. Non-polar deletion mutants of the whole SPI-19 and specific T6SS core components revealed that this T6SS was necessary for Salmonella Gallinarum survival within macrophages at late time points after infection. Furthermore, the SPI-19 T6SS function could not be linked to Salmonella-induced cytotoxicity or cell death of infected macrophages. To determine the contribution of SPI-19 T6SS to Salmonella pathogenesis, T6SS mutants were tested in competitive infection assays against the wild-type Gallinarum parental strain. Oral infection of four-day-old White Leghorn chicks revealed that T6SS mutants colonized the ileum, ceca, liver and spleen poorly compared to the wild-type strain. Restitution of SPI-19 to the ΔSPI-19 mutant, using VEX-Capture, complemented this colonization defect. Altogether, the data indicate that SPI-19 and the T6SS encoded therein contributes to macrophage intracellular survival and colonization of chicks infected by S. Gallinarum. To assess the impact of carrying a complete T6SS locus on the ability of S. Enteritidis to colonize the avian host, the SPI-19 from Gallinarum was transferred to Enteritidis. In vivo experiments showed that presence of a complete SPI-19 significantly increased the ability of Enteritidis to colonize the ileum, liver and spleen of infected chicks by day 1 post-infection. This colonization advantage was not lasting however, as this strain presented a strong colonization defect for each organ analyzed from day 3 post infection to the conclusion of the experiment. These results suggest that transfer of SPI-19 from S. Gallinarum has a negative impact on the ability of S. Enteritidis to colonize the avian host. In this context is tempting to speculate that loss of the SPI-19 T6SS corresponds to a pathoadaptative event during S. Enteritidis evolution. In addition, this is the first report of the use of Vex-Capture method to assess the effect of Genomic Island transfer in an animal model of bacterial infection. The recent discovery of Type VI Secretion Systems (T6SS) has opened a new chapter in the study of Salmonella host and environmental adaptation. Whether Salmonella encodes T6SSs and whether they could be considered as quantum leap evolution events are some of the questions that the discovery of T6SS in bacterial genomes generated. In this thesis, we have expanded the current knowledge on bacterial T6SSs and Salmonella virulence potential by: i) the identification and description of 4 novel Salmonella Pathogenicity Islands (SPI-19, SPI-20, SPI-21 and SPI-22) encoding phylogenetically distinct T6SS loci, ii) the discovery of a novel “evolved” VgrG protein, which suggested for the first time a role for T6SSs in interbacterial relationships, iii) identifying that the SPI-19 T6SS contributes to Salmonella intracellular survival in macrophages and iv) determining that the SPI-19 T6SS contributes to chicken colonization by S. Gallinarum.
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Rol del sistema de secreción tipo seis (T6SS) codificado en la isla SPI-19 de Salmonella enterica serovares Enteritidis y Gallinarum, en la interacción con macrófagos

Jiménez Romaguera, Juan Cristóbal January 2010 (has links)
Salmonella Enteritidis y Salmonella Gallinarum son dos patógenos importantes para el hospedero aviar. El primero causa infecciones silentes en aves de postura, lo que le permite infectar los huevos y tras el consumo de éstos, llegar al hospedero humano. El segundo, causa en el ave un cuadro de gastroenteritis severa y posterior tifoidea aviar, generando graves consecuencias económicas y productivas. Previamente, mediante herramientas bioinformáticas, identificamos una nueva isla de patogenicidad no caracterizada en cuatro serotipos distintos de Salmonella, entre ellos Gallinarum y Enteritidis. Esta fue nombrada isla de patogenicidad 19 de Salmonella (SPI-19), y codificaría para un sistema de secreción tipo VI (T6SS), un sistema de secreción de proteínas el cual se encuentra ampliamente distribuido entre las bacterias Gram negativo. S. Gallinarum posee codificado en la SPI-19 todos los genes esenciales para un T6SS funcional, mientras que S. Enteritidis posee una versión trunca de la isla, y sólo posee algunos genes del T6SS. Este sistema cumpliría una serie de funciones en los procesos patogénicos dependiendo de la bacteria, y hasta el momento se ha descrito su participaciòn en adherencia, invasión, citotoxicidad y proliferación intracelular. Al analizar filogenéticamente el T6SS codificado en SPI-19 se descubrió que se encontraba cercano a los sistemas codificados en bacterias como Vibrio cholerae y Aeromonas hydrophila. En estos patógenos ya se ha descrito un rol del T6SS en la interacción con células del sistema inmune, particularmente en la sobrevida y citotoxicidad en líneas celulares de macrófagos. Debido a que la capacidad de Salmonella para sobrevivir dentro de macrófagos es un proceso fundamental para su diseminación sistémica y colonización de órganos blanco, en esta memoria se propuso determinar el papel que cumple el T6SS codificado en SPI-19 en la interacción con macrófagos murinos. Para esto se estudió la capacidad de sobrevivir al interior de macrófagos RAW 264.7 de mutantes en genes estructurales y efectores del T6SS. A su vez, se analizó la capacidad citotóxica de estas cepas. Los resultados muestran que mutantes de S. Gallinarum presentan una supervivencia menor a tiempos tardíos de infección. En S. Enteritidis la mutante para SPI-19 no presenta una disminución significativa de la sobrevida. En ambos serotipos no se presentan cambios en la citotoxicidad. También se estudió la expresión en la infección de macrófagos del efector VgrG mediante una fusión con el fluoróforo GFP. Esto reveló una rápida expresión de la fusión, lo que sugiere que el contacto bacteria-macrófago gatilla la expresión del efector. Estos resultados demuestran que la isla SPI-19 codifica para un T6SS funcional, que participa en un proceso esencial de la infección por Salmonella.
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Analyse des différences d'invasion cellulaire entre Salmonella gallinarum et Salmonella enteritidis, deux sérotypes génétiquement proches / Analysis of cellular invasion differences between Salmonella gallinarium and Salmonella enteridis, two genetically closed serotypes

Rossignol, Aurore 30 October 2014 (has links)
Salmonella Gallinarum (SG) et Salmonella Enteritidis (SE) sont deux sérotypes génétiquement proches. Pourtant, chez la volaille, SG induit une infection systémique létale tandis que SE est responsable d’une infection systémique transitoire et d’un portage intestinal asymptomatique. De plus, SE est un sérotype ubiquiste tandis que SG est spécifique d’hôte. Outre ces différences in vivo, ces deux sérotypes présentent des différences in vitro. Nous avons montré que SG est in vitro moins invasif que SE. Ce phénotype est indépendant de l’origine aviaire ou non-aviaire des cellules en dépit du tropisme de SG pour la volaille. LeT3SS-1, le facteur d’invasion majeur chez Salmonella, est composé d’un appareil de sécrétion et des effecteurs transloqués par celui-ci. Nous avons montré que les composants du T3SS-1 sont autant exprimés chez SG que chez SE et que tous deux possèdent un appareil de sécrétion fonctionnel. Pourtant, l’étude des capacités d’invasion dépendantes du T3SS-1 suggère que ce facteur est impliqué dans le défaut d’invasion de S. Gallinarum. L’analyse des gènes codant les effecteurs transloqués par le T3SS-1 a montré qu’il existe des mutations chez SG pouvant être à l’origine de ce défaut d’invasion. / Salmonella Gallinarum and Salmonella Enteritidis are genetically closed. However, whereas SG induces lethal systemic infection in poultry, SE is responsible for transient systemic infection and asymptomatic intestinal carriage. Moreover, SE is ubiquitous whereas SG is poultry specific. These serotypes also present in vitro differences. We have shown that SG is in vitro less invasive than SE whatever the avian or non-avian cell origin, in spite of SG’s tropism for avian species. T3SS-1, the main invasion factor in Salmonella, is composed of a secretion apparatus and its translocated effectors. We have shown that T3SS-1 components a expressed in a similar way by SE and SG and both harbor a functional secretion apparatus. However, study of T3SS-1 dependent invasion abilities suggested that T3SS-1 is involved in SG’s invasion defect. Sequence analysis has revealed that SG possesses several mutations in genes encoding main T3SS-1 effectors, that could explain the low invasive phenotype.
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Patogenicidade de Salmonella Gallinarum com deleção dos genes phoP e phoQ (SG∆phoPQ) em aves comerciais /

Rodrigues Alves, Lucas Bocchini January 2017 (has links)
Orientador: Angelo Berchieri Junior / Coorientador: Oliveiro Caetano de Freitas Neto / Banca: Terezinha Knöbl / Banca: Marita Vedovelli Cardozo / Resumo: RESUMO - Salmonella Gallinarum (SG) é um patógeno hospedeiro-específico que causa o tifo aviário, doença sistêmica severa que é considerada uma das principais preocupações da indústria avícola mundial. Quando infecta a ave, SG utiliza mecanismos de evasão para sobreviver e replicar no interior de macrófagos. Nesse contexto, os genes phoPQ codificam o sistema regulatório de dois componentes (PhoPQ) que regula genes de virulência responsáveis pela adaptação de Salmonella spp. a fatores antimicrobianos como baixo pH, peptídeos antimicrobianos e baixas concentrações de cátions bivalentes. No presente estudo, objetivou-se investigar a função desses genes para SG. Assim, uma estirpe de SG com genes phoPQ defectivos (SG ∆phoPQ) foi construída e sua patogenicidade avaliada em aves poedeiras de 20 dias de vida susceptíveis ao tifo aviário. SG ∆phoPQ não causou sinais clínicos nem mortalidade em aves desafiadas oralmente, sendo não-patogênica. Ademais, essa estirpe não foi recuperada de fígados e baços. Por outro lado, aves desafiadas subcutaneamente com a estirpe mutante tiveram alterações patológicas discretas a moderadas e baixas contagens bacterianas em tecidos de fígado e baço. A partir dos dados, observa-se que SG ∆phoPQ é atenuado para aves o que sugere que ambos os genes são importantes durante a infecção sistêmica em aves por SG. / Abstract: ABSTRACT - Salmonella Gallinarum (SG) is a host-restrict pathogen that causes fowl typhoid, a severe systemic disease that is one of the major concerns to the poultry industry worldwide. When infecting the bird, SG makes use of evasion mechanisms to survive and to replicate within macrophages. In this context, phoPQ genes encode a two-component regulatory system (PhoPQ) that regulates virulence genes responsible for adaptation of Salmonella spp. to antimicrobial factors such as low pH, antimicrobial peptides and deprivation of bivalent cations. Herein, we aimed to investigate the role of the mentioned genes to SG. Thus, a phoPQ-depleted SG strain (SG ∆phoPQ) was constructed and its virulence assessed in twenty-day-old laying hens susceptible to fowl typhoid. SG ∆phoPQ did cause neither clinical signs nor mortality in birds orally challenged, being non-pathogenic. Furthermore, this strain was not recovered from livers or spleens. On the other hand, chickens challenged subcutaneously with the mutant strain had discreet to moderate pathological changes and also low bacterial counts in liver and spleen tissues. These findings show that SG ∆phoPQ is attenuated to susceptible chickens and suggest that both genes are important during chicken systemic infection by SG. / Mestre
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Importância do flagelo para a patogenicidade de Salmonella enterica subespécie Enterica Sorovar Gallinarum biovar Gallinarum

Freitas Neto, Oliveiro Caetano de [UNESP] 23 February 2012 (has links) (PDF)
Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-23Bitstream added on 2014-06-13T20:05:16Z : No. of bitstreams: 1 freitasneto_oc_dr_jabo.pdf: 1961940 bytes, checksum: 7291da4800867b31fbd9a7d43c4a44cd (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / S. Gallinarum (SG) provoca o tifo aviário, doença sistêmica com alta mortalidade em aves. Esse biovar é imóvel devido à falta de flagelos. Foi sugerido que a ausência de flagelo resultaria na indução de resposta pró-inflamatória de menor intensidade na mucosa intestinal, favorecendo o desenvolvimento da infecção sistêmica. Para investigar essa hipótese, um mutante de SG capaz de produzir flagelos (SG Fla+) foi construído. Analisou-se a capacidade deste mutante de invadir células epiteliais renais (CRGs), sobreviver em macrófagos da linhagem HD 11 e induzir a expressão de genes responsáveis por mediadores da resposta imune nestas células, em conjunto com outras estirpes de Salmonella spp. Aliado a isso, comparou-se a patogenicidade de SG Fla+ e SG para aves de uma linhagem para postura comercial, avaliando-se a mortalidade e as alterações macroscópicas. Os resultados demonstraram que o flagelo aumentou a capacidade de invasão das estirpes para CRGs, mas não alterou a sobrevivência de SG Fla+ no interior dos macrófagos HD 11. SG Fla+ induziu a maior aumento da expressão de CXCLi2, IL-6 e de iNOS em CRGs que as estirpes sem flagelos (p<0,05). A expressão de genes responsáveis por mediadores da resposta imune em macrófagos HD11 não esteve ligada a presença de flagelo. SG Fla+ provocou menores taxas de mortalidade que SG (p<0,05). Após 28 dias do desafio, SG Fla+ foi isolada no conteúdo de alguns cecos com alterações sugestivas de inflamação / S. Gallinarum (SG) is the causative agent of fowl typhoid, a systemic disease responsible for high mortality rates in birds. This biovar is non-motile due to the lack of flagella. It has been proposed that the absence of flagellum would provoke less pro-inflammatory immune response in the gut, favoring the development of systemic infection. In order to investigate this, a SG mutant strain capable of producing flagella (SG Fla+) was constructed. The capability of this mutant and other Salmonella spp. strains in invading chicken kidney cells (CKCs), surviving in HD 11 macrophages and inducing inflammatory responses in these cells were assessed. In adittion, the pathogenicity of SG Fla+ and SG was comparatively assessed in commercial laying hens. Mortality rates and gross lesions were evaluated. The results shown that flagellum increased the invasiveness of strains to CKCs while its presence did not change the survival of SG Fla+ in HD11 macrophages. SG Fla+ induced higher levels of CXCLi2, IL- 6 and iNOS gene expression than non-flagellated strains did (p<0.05). The expression of genes responsible for mediators of immune responses in infected HD11 macrophages were not related to the presence of flagella. SG Fla+ caused lower mortality rates than SG (p<0.05). SG Fla+ was recovered from the contents of caeca which presented inflammation-like macroscopic alterations not observed in birds infected with SG
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Avaliação da patogenia de estirpes de Salmonella enterica SUBSP. enterica sorotipo Gallinarum biovar Gallinarum com os genes responsáveis pela expressão de flagelo ativos

Lopes, Priscila Diniz [UNESP] 03 December 2013 (has links) (PDF)
Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:49Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-12-03Bitstream added on 2014-08-13T18:00:25Z : No. of bitstreams: 1 000759978.pdf: 3044978 bytes, checksum: 9f473a1b86cb80664b6c1dbec2f5f431 (MD5) / O tifo aviário é uma doença sistêmica provocada por Salmonella enterica subsp. enterica sorovar Gallinarum biovar Gallinarum (SG), bactéria que não possui flagelos. Acredita-se que por não produzir flagelos, SG seria pouco reconhecido pelo sistema imune. Deste modo provocaria inflamação de menor intensidade na mucosa, atravessando as barreiras intestinais com mais facilidade e assim desencadeando enfermidade sistêmica severa. Com intuito de investigar essa hipótese, em estudo prévio, construiu-se um mutante de SG capaz de produzir flagelos (SG Fla+) o qual desencadeou resposta imune pro-inflamatória em células de cultivo, além de ter sido menos patogênico para as aves que a estirpe selvagem de SG. No entanto, notou-se que SG Fla+ tende a interromper a produção de flagelos após dois ou mais cultivos consecutivos em meio sólido, tornando-se fenotipicamente aflagelado (SG Fla-). O presente estudo teve por objetivo comparar a patogenicidade de SG Fla+, SG Fla- e SG para aves susceptíveis ao tifo aviário. No primeiro experimento, as taxas de mortalidade provocadas pelas estirpes e excreção fecal das mesmas foram avaliadas. Enquanto que no segundo ensaio, avaliou-se a capacidade de colonização cecal, invasão das estirpes em fígado e baço e ainda a presença e intensidade de lesões macro e microscópicas em órgãos. SG Fla+ provocou mortalidade inferior às estirpes aflageladas, quando utilizou-se o inóculo diluído (106 UFC). Os resultados da excreção fecal demonstram que SG Fla+ foi a estirpe mais excretada. Pôde-se observar que SG e SG Fla- foram recuperadas do conteúdo cecal em quantidades mais elevadas que SG Fla+. SG e SG Fla- foram isoladas mais cedo e em maiores quantidades que SG Fla+ em fígado e baço. No fígado verificou-se hepatomegalia, degeneração, congestão, alterações na coloração (amarelo-esverdeado a esverdeado), reatividade linfoide ... / The fowl typhoid is a systemic disease of chickens caused by Salmonella enterica subsp. enterica serovar Gallinarum biovar Gallinarum (SG), a microorganism that does not produce flagella. It is suggested that due to the absence of flagella SG is poorly recognized by the bird immune system. As a result, just a mild inflammation is induced in the gut mucosa, favoring the development of a severe systemic infection. In order to investigate this hypothesis, in a previous study, a mutant of SG capable of producing flagella (SG Fla+) was constructed. This mutant was able to trigger mRNA pro-inflammatory cytokines e chemokines in cultured cells and was less pathogenic to birds than the wild type strain. However, it was noticed that SG Fla+ trends to stop flagella production after culturing two or more times on solid medium, becoming non-flagelated (SG Fla-). The present study aimed at comparing the pathogenicity of SG Fla+, SG Fla- and SG to birds. In the first experiment, mortality rates caused by strains and fecal excretion were evaluated. In the second assay, the ability of strains in colonizing the ceca and invading liver and spleen were compared. In addition to this, the presence and intensity of macroscopic and microscopic lesions in organs were evaluated. When inoculated in the lower amount (106 CFU) SG Fla+ provoked less mortality than the non-flagellate strains. The results of fecal excretion indicate that SG Fla+ was more excreted than the other strains. It was observed that SG and SG Fla- were recovered from cecal contents in higher amounts than SG Fla+. SG Fla- and SG were isolated earlier and in higher amounts from liver and spleen. In the liver degeneration, congestion, changes in color (greenish-yellow to greenish), lymphoid reactivity and multifocal areas of necrosis were noticed. Spleen was enlarged and congested; foci of necrosis in the white pulp and lymphoid depletion were also ...
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Análise comparativa dos genomas de Salmonella enterica subsp. enterica sorovar Gallinarum biovares Gallinarum 287/91 e Pullorum 449/87 para identificação de regiões de diferenças (RODs) /

Batista, Diego Felipe Alves. January 2013 (has links)
Orientador: Angelo Berchieri Junior / Coorientador: Oliveiro Caetano de Freitas Neto / Banca: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: Marcelo Brocchi / Resumo: Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Gallinarum biovar Gallinarum (S. Gallinarum) é o agente causador do tifo aviário, uma doença septicêmica que afeta principalmente aves adultas. Enquanto que Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Gallinarum biovar Pullorum (S. Pullorum) é o micro-organismo causador da pulorose, uma doença sistêmica de aves jovens que evolui para infecção persistente em algumas das que se recuperam da enfermidade. Essas bactérias são genética e fenotipicamente semelhantes, mas causam doenças distintas nos seus hospedeiros. Ainda não se sabe quais seriam as informações genéticas responsáveis pelas diferenças na patogenia e epidemiologia do tifo aviário e da pulorose. Com o intuito de investigar essas diferenças, realizou-se o presente estudo, o qual teve por objetivo a comparação dos genomas de S. Gallinarum 287/91, S. Pullorum 449/87 e de S. Pullorum RKS5078 para identificação de regiões de diferenças ("regions of difference" - RODs). Foram identificadas e caracterizadas 68 RODs, buscando correlacioná-las com a patogenicidade desses micro-organismos. Além disso, verificou-se a conservação de algumas dessas RODs em 25 estirpes de S. Gallinarum e 17 de S. Pullorum, todas isoladas de aves com tifo aviário ou pulorose. De modo geral, as RODs continham genes relacionados à funções celulares (reparo de DNA e desagregação de proteínas celulares), produção de energia e virulência. No presente estudo foi observado que a maioria das RODs conservadas era gerada por deleções que, putativamente, provocaram perda de sua função em S. Pullorum. Por esse motivo, foi possível sugerir que a diferente epidemiologia de S. Pullorum poderia ser decorrente de perdas gênicas e não de características adquiridas... / Abstract: Salmonella enterica subspecie enterica serovar Gallinarum biovar Gallinarum (S. Gallinarum) is the causative agent of fowl typhoid, a septicaemic disease that affects mainly adult birds, whereas Salmonella enterica subespécie enterica serovar Gallinarum biovar Pullorum (S. Pullorum) causes pullorum disease, a systemic disease of young birds that can evolve for persistent infection in some of the birds that recovered. These two bacteria are genetic and phenotypically similar but cause distinct diseases. The genetic bases that would be responsible for these differences are still unknown. For this reason the present study was elaborated and aimed at comparing S. Gallinarum 287/91, S. Pullorum 449/87 and S. Pullorum RKS5078 whole genomes in order to identify regions of difference (RODs). In total, 68 RODs were identified and characterized attempting to correlate them with pathogenicity features of S. Gallinarum and S. Pullorum. Furthermore, the conservation status of some RODs was verified in 25 strains of S. Gallinarum and 17 strains of S. Pullorum, all of them isolated from birds with fowl typhoid or pullorum disease. Overall, the RODs have genes involved in cellular functions (as DNA repair and protein disaggregation), energy production and virulence. In the present study, it was noticed the majority of conserved RODs were generated by deletions in genes which, putatively, would lead to loss of their function in S. Pullorum. Consequently, it was feasible to suggest that S. Pullorum epidemiology would be a negative characteristic stemming from gene losses rather than acquired features... / Mestre

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