Ingeniero en Biotecnología Molecular. / La chaperona bacteriana periplasmática CusF es parte del sistema de resistencia a cobre
CusCFBA. CusF une cobre (I) en el periplasma bacteriano mediante una histidina y dos
metioninas muy conservadas en las bacterias. En Acidithiobacillus ferrooxidans, la
histidina del sitio de unión a cobre de CusFAf se encuentra sustituída por metionina. Se ha
determinado que a pesar que la afinidad de la histidina por cobre es mayor que la de la
metionina a pH neutro, esta última presenta una mayor afinidad por cobre a pH ácido.
Siendo A. ferrooxidans una bacteria que vive en ambientes ácidos, esta sustitución podría
estar relacionada con la adaptación al periplasma ácido de la bacteria. Se analizó
bioinformáticamente el sitio de unión a cobre de CusF para determinar las especies en las
que se encuentra esta sustitución. Se encontró que sólo el género Acidithiobacillus
presenta esta sustitución. Adicionalmente se midió la unión de cobre a la CusF de A.
ferrooxidans y el efecto que tiene esta sustitución. Para ello se clonó el gen cusF3Af en E.
coli y se realizó una mutación sitio dirigida de su metionina 66 cambiándola por histidina.
Luego de expresar y purificar ambas proteínas (silvestre y mutada) se midió in vitro su
capacidad de unir cobre tanto a pH ácido como neutro. A pH 7, la CusF3 de A.
ferrooxidans presentó unión a cobre con un valor experimental de 0.7 átomos de cobre
por proteína mientras que la mutante M66H unió 0.3 átomos de cobre por proteína (la
misma cantidad de cobre que el control). A pH ácido no fue posible medir la unión de
cobre con el método utilizado. Se concluye que la sustitución de histidina por metionina
en la CusF3Af es exclusiva del género Acidithiobacillus y que esta chaperona tiene
capacidad de unir cobre a pH neutro. / The periplasmatic metallochaperone CusF is part of the CusCFBA copper resistance
system. CusF binds Cu(I) through a conserved site consisting of 1 histidine and 2
methionines. In Acidithiobacillus ferrooxidans, this histidine present in the position 66 of
CusFAf is found substitued by a methionine. It has been determined that while the affinity
of copper for histidine is higher than that for methionine at neutral pH, the latter has higher
affinity for the metal at low pH. Since A. ferrooxidans lives in acidic environments, it is
proposed that this subsitution could be an adaptation to the acid periplasm of this
bacterium. The copper binding site of CusF was analyzed bioinformatically to determine
the species in which this subsitution is found. This substitution was only present in the
CusF of species from the genus Acidithiobacillus. Additionally, copper binding capacity
of the A. ferrooxidans CusF was measured, and the effect of this substitution was
investigated. To fulfill that purpose, the cusF3Af gene was cloned into E. coli and a site
directed mutation was performed to replace methionine 66 with histidine. Both wild type
and mutated proteins were expressed and purified to measure in vitro their copper binding
capacity at both neutral and acid pH. A copper binding capacity of 0,7 copper atoms per
protein was found for the wild type CusF3Af, while the M66H mutant was able to bind 0,3
copper atoms per protein (the same amount of copper present in the negative control). It
was not possible to perform this measurement under acidic conditions. It was concluded
that the subsitution of histidine for methionine in CusF3Af is exclusive of the
Acidithiobacillus genus, and that this copper chaperone has the capacity to bind copper at
neutral pH. / Enero 2018
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/145557 |
| Date | 28 June 2017 |
| Creators | Cortez Milán, Diego Nahuel. |
| Contributors | Jerez Guevara, Carlos A. |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | English |
| Type | Tesis |
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