Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los
requisitos para optar al Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / Los fotorreceptores se encuentran ampliamente distribuidos en todos los
dominios de la vida, y se caracterizan por experimentar cambios de conformación
inducidos por la presencia o ausencia de luz. Estas moléculas, junto con distintas
herramientas ópticas, han permitido la aparición de la optogenética, que consiste en el
uso de luz para permitir el comando de distintos procesos biológicos con un fino control
espacio-temporal. El uso de luz como tratamiento inductor se destaca debido a que es
una señal fácil de regular y con gran resolución espacial, popularizando su uso en
sistemas mamíferos. Recientemente, el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae
ha sido también adoptado como una plataforma para este tipo de aproximaciones, ya
que no presenta fotorreceptores descritos, y por lo tanto, no es capaz de sensar la luz.
Recientemente, se ha descrito un sistema optogenético llamado Fungal Light-
Oxygen-Voltage (FUN-LOV). Este se basa en la interacción de los dominios LOV de las
proteínas WHITE COLLAR 1 (WC-1) y VIVID (VVD) del hongo Neurospora crassa, y en
la arquitectura clásica de los sistemas de doble híbrido. FUN-LOV presentó notables
niveles de inducción en la transcripción de un gen reportero luciferasa, y bajo ruido en
condiciones de oscuridad, por lo que se presenta como uno de los sistemas
optogenéticos más robustos reportados hasta la fecha. Sin embargo, poco se sabe sobre el papel que cumplen los distintos dominios de las proteínas que participan en este tipo
de arquitectura para la funcionalidad y robustez del sistema optogenético.
Es por esto que este seminario de título se presenta como una revisión de la
modularidad y robustez del sistema FUN-LOV. Para esto se intercambiaron los dominios
de unión a DNA (DBD) y de activación (AD) del sistema original por el de diferentes
factores de transcripción (TF), ampliamente descritos en S. cerevisiae, tales como el
DBD de las proteínas LexA y Cup2p, y el AD de VP16.
Con el objetivo de realizar esta evaluación se generaron las correspondientes
construcciones genéticas in silico, para luego ensamblarlas in vivo usando clonamiento
por recombinación en levaduras. La evaluación de los sistemas se realizó de forma
indirecta a través de la cuantificación de la actividad del gen reportero luciferasa (LUC)
en respuesta a luz azul (BL) y al estímulo particular de cada dominio intercambiado
(cobre, luz roja).
Como resultado se obtuvo que ambos sistemas en los que se hizo un cambio a
nivel de DBD/promotor, presentaron una pérdida en su funcionalidad y robustez, lo que
sugiere fuertemente que dichos módulos son de vital importancia para este tipo de
sistemas optogenéticos. Por su parte, el sistema FUN-LOV VP16 mantuvo su
funcionalidad como interruptor-optogenético, pero presentó un menor nivel de inducción
de actividad luciferasa, además de una cinética más lenta comparado con el sistema ya
reportado.
Finalmente, se concluye que el sistema FUN-LOV no es modular a nivel de
DBD/promotor, ya que al remplazar estos módulos el sistema pierde su funcionalidad y robustez. Por otro lado, el sistema es modular a nivel de AD, ya que mantiene su
funcionalidad, mientras que la robustez varía dependiendo de la naturaleza del AD a
utilizar. / Photoreceptors are widely distributed in all the domains of life and are
characterized by undergoing conformational changes induced by the presence or
absence of light. These molecules, together with different optical tools, have allowed the
appearance of optogenetics, which involves the use of light to allow the command of
different biological processes with a fine spatio-temporal control. Light as an inducer
treatment is remarkable since it is easy to regulate and provides great spatial resolution,
which has boosted its use in mammalian systems. Recently, the model organism
Saccharomyces cerevisiae has been adopted as an ideal platform for this kind of
systems, due to the absence of described photoreceptors, and therefore, it is not capable
to sense the light.
Recently, an optogenetic system called FUN-LOV has been described. FUN-LOV
is based on the interaction of Neurospora crassa photoreceptors WC-1 and VVD, and on
the classical architecture of the double hybrid systems. FUN-LOV showed remarkable
levels of luciferase gene expression, and low noise in dark conditions, so it is presented
as one of the most robust optogenetic systems reported so far. Nonetheless, little is
known about the role played by the different protein domains for the functionality and
robustness of the optogenetic system.
Therefore, this title seminar is presented as a revision of modularity and
robustness of the FUN-LOV system. For this, the DBD and AD of the original system
were exchanged for different TF domains widely described in S. cerevisiae, such as the
DBD of the LexA and Cup2 proteins, and the AD of VP16.
The evaluation was carried out generating the genetic constructions in silico, to
then assemble them in vivo using yeast recombinational cloning. The evaluation of the
systems was performed indirectly through the activity quantification of LUC reporter gene
in response to BL and the particular stimulus for each domain exchanged (copper, red
light).
As results, a loss of functionality and robustness was observed when the domains
where exchanged at the DBD/promoter level, strongly suggesting that these modules are
crucial for this type of optogenetic systems. On other side, the FUN-LOV VP16 system
keep its functionality as an opto-switch, but showed a lower induction of luciferase
activity, and slower kinetics in relation with the already reported system.
Finally, we concluded that FUN-LOV is not a modular system at the DBD/promoter
level, because functionality and robustness of the system are lost when these modules
were replaced. Nonetheless, the system is modular at the AD level, since it maintained
its functionality, meanwhile the robustness varies depending on the nature of the AD
used. / FONDECYT-Regular 1171151 y el Instituto Milenio de Biología Integrativa (iBio).
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/168115 |
| Date | 22 March 2019 |
| Creators | Romero Quezada, Andrés Aarón Baruc |
| Contributors | Alcaíno Gorman, Jennifer Cecilia, Universidad de Chile. Facultad de Ciencias. Escuela de Pregrado |
| Publisher | Universidad de Chile. |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Chile, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ |
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