La apoptosis es un tipo de muerte celular programada que participa en procesos fisiológicos y fisiopatológicos. Muchas enfermedades neurodegenerativas de la retina involucran la muerte por apoptosis de las neuronales retinales, y tienen una característica en común, la presencia de daño oxidativo. Este estrés activa las vías que conducen a la apoptosis, y por lo tanto el conocimiento de los mecanismos por los cuales induce dicha activación es fundamental en el desarrollo de futuras estrategias terapéuticas. Durante las últimas dos décadas los esfingolípidos han sido intensamente estudiados por su participación en la apoptosis y supervivencia celular. Esfingolípidos simples como la ceramida y el producto de su deacilación, la esfingosina, son segundos mensajeros proapoptóticos en muchos tipos celulares, mientras que la esfingosina-1-fosfato (S1P, por sphingosine-1-phosphate), que se sintetiza por fosforilación de esfingosina, tiene importantes funciones como promotor de la proliferación y supervivencia. Por lo tanto, la regulación del metabolismo de los esfingolípidos podría ser una herramienta importante para controlar la apoptosis durante las enfermedades neurodegenerativas. Trabajos anteriores del laboratorio demuestran que el daño oxidativo induce apoptosis en cultivos primarios de neuronas retinales, fotorreceptoras y amacrinas, de rata. Además establecimos que la ceramida es un mediador de la apoptosis por estrés oxidativo en fotorreceptores in vitro. La inducción de daño oxidativo con paraquat (PQ) incrementa los niveles de ceramida, a través de su síntesis de novo, y la inhibición de esta síntesis evita la apoptosis. Puesto que la ceramida puede degradarse a esfingosina, en esta tesis nos propusimos determinar si la esfingosina también es un mediador de la apoptosis en los fotorreceptores in vitro. Realizando experimentos metabólicos en cultivos neuronales puros de retina de rata, tratados con [3H]palmitato, determinamos que el daño oxidativo aumenta los niveles de esfingosina en los fotorreceptores, antes de la activación de la apoptosis. Además, mediante el método de TUNEL y marcación con Anexina/ioduro de propidio establecimos que el agregado exógeno de esfingosina también indujo apoptosis en las neuronas de la retina in vitro, asociada a la pérdida del potencial de membrana mitocondrial y la translocación del citocromo c de las mitocondrias al citosol. En diversos tipos celulares, la degradación de la ceramida a esfingosina, catalizada por ceramidasas, es necesaria para desencadenar la apoptosis. Para determinar si la apoptosis de los fotorreceptores, inducida por ceramida o por daño oxidativo, requiere de la síntesis de esfingosina, utilizamos un inhibidor de la ceramidasa alcalina. Demostramos que la inhibición de la ceramidasa alcalina bloquea la apoptosis activada por PQ o por ceramida exógena en los fotorreceptores. Muchos factores tróficos modulan el metabolismo de los esfingolípidos. En nuestro laboratorio demostramos que el ácido docosahexaenoico (DHA, por docosahexaenoic acid), un factor trófico para los fotorreceptores, los protege del daño oxidativo y dicha protección requiere de la formación de glucosilceramida. Uno de los objetivos de esta tesis fue estudiar si el DHA regula otros pasos del metabolismo de los esfingolípidos. Investigamos si el DHA controla la síntesis de S1P que como ya mencionamos, es un esfingolípido con importantes propiedades anti-apoptóticas. La S1P es sintetizada por la fosforilación de esfingosina a través de la actividad de esfingosinas quinasas, de las cuales se conocen dos isoformas, SphK1 y SphK2. Con diversas técnicas citoquímicas, determinamos que DHA protege a los fotorreceptores de la apoptosis por daño oxidativo o por agregado de ceramida o esfingosina, y que la inhibición de la formación de S1P, catalizada por la SphK1 bloquea el efecto protector del DHA. Además, incubando a cultivos neuronales con [3H]esfingosina, establecimos que el DHA promueve la metabolización de la esfingosina a S1P. Por lo tanto, uno de los mecanismos por los cuales el DHA tiene un efecto antiapoptótico en los fotorreceptores sería a través del incremento de la síntesis de S1P, un esfingolípido antiapoptótico, disminuyendo los niveles de esfingosina, uno antiapoptótico. S1P también puede actuar extracelularmente a través de sus receptores de membrana. Existen 5 subtipos de estos últimos, denominados S1P1-5. En esta tesis, demostramos que la S1P exógena protege a los fotorreceptores de retina del daño oxidativo o de la apoptosis inducida por esfingosina a través de su receptor de membrana S1P3, puesto que el uso de un antagonista para éste bloquea el efecto protector de S1P. Debido a que luego de la síntesis de S1P, ésta puede ser transportada al medio extracelular, decidimos evaluar si DHA actúa a través de este mecanismo y la posterior activación del receptor S1P3. Demostramos que el bloqueo del receptor S1P3 no inhibe el efecto protector del DHA sobre los fotorreceptores de la apoptosis por daño oxidativo o esfingosina exógena. Por lo tanto, sugerimos que el DHA no requiere de la activación de S1P3 para proteger a los fotorreceptores del daño oxidativo; el DHA promovería la síntesis de S1P, que luego actuaría como mensajero intracelular o activaría a otros receptores distintos de S1P3. Las células gliales de Müller tienen importantes funciones de sostén metabólico y trófico para las neuronas de retina.Además, las células gliales podrían ser una fuente potencial de células madre. Por eso, el estudio de su capacidad para proteger a las neuronas así como de regenerarlas, podría hacer aportes al desarrollo de terapias para las enfermedades neurodegenerativas. Investigamos si las células de Müller son capaces de posponer la apoptosis neuronal por daño oxidativo en cocultivos neurogliales. Utilizando técnicas citoquímicas demostramos que los oxidantes PQ y peróxido de hidrógeno no activan la apoptosis glial ni la neuronal en cultivos gliales puros y cocultivos neurogliales, respectivamente. Mediante técnicas inmunocitoquímicas y Western blot establecimos que el estrés oxidativo indujo la proliferación glial, la disminución de la expresión de marcadores de diferenciación glial in vitro y un incremento de aquellos que indican dediferenciación. Por esto, proponemos que el estrés oxidativo promueve la proliferación y dediferenciación de las células de Müller in vitro sugiriendo su capacidad para regenerar neuronas. A su vez, las células gliales protegen a las neuronas fotorreceptoras y amacrinas de la apoptosis inducida por estrés oxidativo. Diversos factores tróficos y diferentes vías de transducción de señales participan en la interacción neurona-glía de Müller, pero no se conoce si los esfingolípidos están involucrados en dicha interacción. Cuando estudiamos el efecto de S1P sobre las células gliales de Müller de retina de rata, por captación de Br-deoxiuiridna y de [3H]timidina, determinamos que este esfingolípido es un potente mitógeno,ya que estimula notablemente la proliferación glial. Investigamos también si S1P participa en los mecanismos desencadenados por las células de Müller para proteger a las neuronas retinales del daño oxidativo. Utilizando un inhibidor de la síntesis de S1P y un antagonista del receptor S1P3, determinamos que la formación de S1P y la activación de S1P3 son necesarias para que las células gliales de Müller promuevan la supervivencia de las neuronas de retina. Los resultados más importantes de esta tesis son: El estrés oxidativo induce la síntesis de esfingosina en fotorreceptores de retina de rata in vitro. El estrés oxidativo requiere de la formación de esfingosina, catalizada por la ceramidasa alcalina, para activar la apoptosis en las neuronas de la retina. La esfingosina, junto con la ceramida, sería un mediador esencial para la activación de la apoptosis debida al daño oxidativo. El DHA estimula la fosforilación de esfingosina a S1P en fotorreceptores. El DHA requiere la formación de S1P para retrasar la apoptosis de las neuronas retinales por estrés oxidativo y el agregado de ceramida o esfingosina. La S1P protege a los fotorreceptores de la apoptosis inducida por daño oxidativo y por agregado de ceramida y esfingosina. La S1P protege a los fotorreceptores de la apoptosis inducida por daño oxidativo y esfingosina exógena a través de la activación del receptor de membrana S1P3. El DHA no requiere de la activación de S1P3 para posponer la apoptosis de los fotorreceptores por estrés oxidativo. La S1P sería un segundo mensajero cuya síntesis sería promovida por el DHA para ejercer sus efectos antiapoptóticos sobre los fotorreceptores de retina. El estrés oxidativo promueve la proliferación y dediferenciación de las células de Müller de rata in vitro, pero no su apoptosis. Las células gliales posponen la apoptosis de las neuronas por daño oxidativo. S1P es un potente inductor de la proliferación de las células de Müller. Las células de Müller requieren de la síntesis de S1P y la activación de S1P3 para proteger a las neuronas de la retina del daño oxidativo. / Role of the sphingolipids on the processes activated by oxidative stress in retinal neurons and glial cells. Apoptosis is a form of programmed cell death involved in many physiological and physiopathological processes. It is involved in retinal neuron death in many retinal neurodegenerative diseases. Oxidative damage is a common factor in these diseases and activates the pathways leading to apoptosis so dilucidating the mechanisms that activate apoptotic death is crucial for developing therapeutic strategies for these diseases. During the last two decades, sphingolipids have been intensively studied due to their participation in cell death and survival. Simple sphingolipids as ceramide and its deacylation product, sphingosine, are well-know second messengers of apoptosis in several cell types, whereas sphingosine-1-phosphate (S1P), synthesized by phosphorylation of sphingosine, has important functions as a positive modulator of proliferation and survival. Therefore, the regulation of sphingolipid metabolism may be an important tool to control apoptosis during neurodegenerative diseases. Previous studies from our lab have shown that oxidative damage induces apoptosis in primary cultures of rat retinal neuron, mainly constituted by photoreceptors and amacrine neurons. We also established that ceramide is a mediator of apoptosis induced by oxidative stress in photoreceptors in vitro. Oxidative damage induced by the oxidant paraquat (PQ) increases ceramide levels by stimulating its de novo biosynthesis. Since ceramide can be deacylated to sphingosine, in this thesis work we have investigated whether sphingosine is also a mediator of apoptosis in photoreceptors in vitro. Incubating neuronal cultures with [3H]palmitate, we have demonstrated that oxidative stress augments sphingosine levels before the onset of apoptosis. Moreover, using TUNEL and Anexin/propidium iodide labeling, we established that addition of exogenous sphingosine induced apoptosis in retinal neurons in vitro. In several cell types, the metabolization of ceramide to sphingosine, catalysed by ceramidases, is necessary to trigger apoptosis. To determine whether ceramide or oxidative stress-induced apoptosis of photoreceptors requires sphingosine synthesis, we used an alkaline ceramidase inhibitor. By a combination of immunochemical techniques, we showed that the inhibition of alkaline ceramidase prevented ceramide or PQ-induced apoptosis in photoreceptors. Many trophic factors modulate sphingolipid metabolism. We have established that docosahexaenoic acid (DHA), a trophic factor for photoreceptors, protects these cells from apoptosis induced by oxidative damage, and the synthesis of glucosylceramide is required for this protection. One of the purposes of this thesis work was to study whether DHA regulates other pathways of sphingolipid metabolism. We investigated whether DHA controls the synthesis of S1P, a sphingolipid with well-known anti-apoptotic properties. S1P is formed by phosphorylation of sphingosine through the activity of sphingosine kinases, of which two isoforms, SphK1 and SphK2, have been identified. We determined that DHA delayed photoreceptor apoptosis induced by oxidative damage and addition of ceramide or sphingosine. Furthermore, inhibition of S1P formation by SphK1 blocked the anti-apoptotic effect of DHA. Incubating neuronal cultures with [3H]sphingosine, we demonstrated that the addition of DHA promoted the synthesis of S1P. Therefore, we suggest that the anti-apoptotic effect of DHA on photoreceptors is achieved through an increase of S1P synthesis, which simultaneously lowers sphingosine levels. S1P can act extracellularly by activating its membrane receptors, which are constituted by 5 different subtypes called S1P1-5. By a combination of cytochemical techniques, we first showed that exogenous S1P protected photoreceptors apoptosis induced by oxidative damage or by addition of sphingosine and ceramide. Using an antagonist of S1P3 receptor, we demonstrated that S1P protection required the activation of S1P3. S1P might be released to the extracellular medium after its synthesis, to act in an autocrine/paracrine manner on its membrane receptors. Hence, we evaluated whether DHA acted through this mechanism, promoting S1P synthesis and its later release and activation of S1P3, to protect photoreceptors. We showed that an antagonist of S1P3 did not affect DHA prevention of photoreceptor apoptosis by oxidative damage or exogenous sphingosine. Therefore, we suggest that DHA does not need S1P3 activation to prevent photoreceptor apoptosis; DHA might promote intracellular S1P synthesis, and S1P would then act as a second messenger or activate S1P receptors other than S1P3. Müller glial cells have important functions in metabolic and trophic support for retina neurons. Moreover, glial has been proposed as a potencial source of stem cells. Therefore, they might be a useful tool to develop therapies for neurodegenerative diseases. We investigated whether Müller glial cells were able to protect neuronal apoptosis induced by oxidative damage in rat neuroglial cocultures. The incubation with oxidants PQ and hydrogen peroxide during twelve hours of incubation did not trigger apoptosis in glial cells or neurons in pure glial cultures and neuroglial cocultures, respectively. Instead, using immunocytochemistry and Western blot, we showed that oxidative stress induced glial proliferation, decrease of expression of glial markers and an increase of dedifferentiation markers. So, we propose that oxidative stress activated proliferation and dedifferentiation of Müller cells in vitro suggesting their capacity to be stem cells. Glial cells also protected amacrine and photoreceptors from oxidative stress-induced apoptosis. Many trophic factors and different signal transduction pathways are involved in Müller glial-neuron crosstalk but little is known concerning a role for sphingolipids in this interaction. We first investigated the effect of S1P in pure glial cultures and demonstrated, by Br-deoxyuridine and [3H]thymidine uptake that S1P is a potent mitogen for Müller cells, which markedly increased their proliferation. We also evaluated whether S1P participated in the mechanisms activated by Müller cells to protect neuronal apoptosis induced by oxidative stress. Using an inhibitor of SphK1 and an antagonist for S1P3 we showed that the synthesis of S1P and the activation of S1P3 are essential for Müller cells to promote the survival of retina neurons. The major findings of this thesis work are: Oxidative stress induces synthesis of sphingosine in rat retina photoreceptors in vitro. Oxidative stress requires the synthesis of sphingosine, catalyzed by alkaline ceramidase, to activate apoptosis in photoreceptors. Sphingosine, together with ceramide, is a key mediator involved in the triggering of apoptosis induced by oxidative stress. DHA stimulates the synthesis of S1P. DHA requires of the synthesis of S1P to prevent neuronal apoptosis induced by oxidative stress and addition of ceramide or sphingosine. S1P protects photoreceptor from oxidative damage and exogenous sphingosine addition through activation of the S1P3 membrane receptor. DHA does not require S1P3 activation to delay apoptosis of photoreceptor by oxidative damage. S1P might be a second messenger, whose intracellular levels are increased by DHA, to promote photoreceptor survival upon oxidative stress, ceramide and sphingosine-induced apoptosis. Oxidative stress promotes the proliferation and dedifferentiation of rat Müller cells in vitro, but not their apoptosis. Müller glia prevents the apoptosis of retinal neurons by oxidative stress. S1P is a potent inductor of proliferation in Müller cells. Müller cells require S1P synthesis and S1P3 activation to protect retina neurons from oxidative damage.

Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / Los fotorreceptores se encuentran ampliamente distribuidos en todos los dominios de la vida, y se caracterizan por experimentar cambios de conformación inducidos por la presencia o ausencia de luz. Estas moléculas, junto con distintas herramientas ópticas, han permitido la aparición de la optogenética, que consiste en el uso de luz para permitir el comando de distintos procesos biológicos con un fino control espacio-temporal. El uso de luz como tratamiento inductor se destaca debido a que es una señal fácil de regular y con gran resolución espacial, popularizando su uso en sistemas mamíferos. Recientemente, el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae ha sido también adoptado como una plataforma para este tipo de aproximaciones, ya que no presenta fotorreceptores descritos, y por lo tanto, no es capaz de sensar la luz. Recientemente, se ha descrito un sistema optogenético llamado Fungal Light- Oxygen-Voltage (FUN-LOV). Este se basa en la interacción de los dominios LOV de las proteínas WHITE COLLAR 1 (WC-1) y VIVID (VVD) del hongo Neurospora crassa, y en la arquitectura clásica de los sistemas de doble híbrido. FUN-LOV presentó notables niveles de inducción en la transcripción de un gen reportero luciferasa, y bajo ruido en condiciones de oscuridad, por lo que se presenta como uno de los sistemas optogenéticos más robustos reportados hasta la fecha. Sin embargo, poco se sabe sobre el papel que cumplen los distintos dominios de las proteínas que participan en este tipo de arquitectura para la funcionalidad y robustez del sistema optogenético. Es por esto que este seminario de título se presenta como una revisión de la modularidad y robustez del sistema FUN-LOV. Para esto se intercambiaron los dominios de unión a DNA (DBD) y de activación (AD) del sistema original por el de diferentes factores de transcripción (TF), ampliamente descritos en S. cerevisiae, tales como el DBD de las proteínas LexA y Cup2p, y el AD de VP16. Con el objetivo de realizar esta evaluación se generaron las correspondientes construcciones genéticas in silico, para luego ensamblarlas in vivo usando clonamiento por recombinación en levaduras. La evaluación de los sistemas se realizó de forma indirecta a través de la cuantificación de la actividad del gen reportero luciferasa (LUC) en respuesta a luz azul (BL) y al estímulo particular de cada dominio intercambiado (cobre, luz roja). Como resultado se obtuvo que ambos sistemas en los que se hizo un cambio a nivel de DBD/promotor, presentaron una pérdida en su funcionalidad y robustez, lo que sugiere fuertemente que dichos módulos son de vital importancia para este tipo de sistemas optogenéticos. Por su parte, el sistema FUN-LOV VP16 mantuvo su funcionalidad como interruptor-optogenético, pero presentó un menor nivel de inducción de actividad luciferasa, además de una cinética más lenta comparado con el sistema ya reportado. Finalmente, se concluye que el sistema FUN-LOV no es modular a nivel de DBD/promotor, ya que al remplazar estos módulos el sistema pierde su funcionalidad y robustez. Por otro lado, el sistema es modular a nivel de AD, ya que mantiene su funcionalidad, mientras que la robustez varía dependiendo de la naturaleza del AD a utilizar. / Photoreceptors are widely distributed in all the domains of life and are characterized by undergoing conformational changes induced by the presence or absence of light. These molecules, together with different optical tools, have allowed the appearance of optogenetics, which involves the use of light to allow the command of different biological processes with a fine spatio-temporal control. Light as an inducer treatment is remarkable since it is easy to regulate and provides great spatial resolution, which has boosted its use in mammalian systems. Recently, the model organism Saccharomyces cerevisiae has been adopted as an ideal platform for this kind of systems, due to the absence of described photoreceptors, and therefore, it is not capable to sense the light. Recently, an optogenetic system called FUN-LOV has been described. FUN-LOV is based on the interaction of Neurospora crassa photoreceptors WC-1 and VVD, and on the classical architecture of the double hybrid systems. FUN-LOV showed remarkable levels of luciferase gene expression, and low noise in dark conditions, so it is presented as one of the most robust optogenetic systems reported so far. Nonetheless, little is known about the role played by the different protein domains for the functionality and robustness of the optogenetic system. Therefore, this title seminar is presented as a revision of modularity and robustness of the FUN-LOV system. For this, the DBD and AD of the original system were exchanged for different TF domains widely described in S. cerevisiae, such as the DBD of the LexA and Cup2 proteins, and the AD of VP16. The evaluation was carried out generating the genetic constructions in silico, to then assemble them in vivo using yeast recombinational cloning. The evaluation of the systems was performed indirectly through the activity quantification of LUC reporter gene in response to BL and the particular stimulus for each domain exchanged (copper, red light). As results, a loss of functionality and robustness was observed when the domains where exchanged at the DBD/promoter level, strongly suggesting that these modules are crucial for this type of optogenetic systems. On other side, the FUN-LOV VP16 system keep its functionality as an opto-switch, but showed a lower induction of luciferase activity, and slower kinetics in relation with the already reported system. Finally, we concluded that FUN-LOV is not a modular system at the DBD/promoter level, because functionality and robustness of the system are lost when these modules were replaced. Nonetheless, the system is modular at the AD level, since it maintained its functionality, meanwhile the robustness varies depending on the nature of the AD used. / FONDECYT-Regular 1171151 y el Instituto Milenio de Biología Integrativa (iBio).

La retina es el tejido neural que tapiza la parte posterior del ojo. En los vertebrados está constituida por cinco clases de neuronas: los fotorreceptores (conos y bastones), las amacrinas, las horizontales, las ganglionares, y las bipolares. Debido a su relativa simplicidad, accesibilidad y a que los distintos tipos celulares están organizados formando un tejido altamente estructurado, la retina ha sido ampliamente utilizada como tejido modelo de estudio del sistema nervioso central, y es la estructura neural más estudiada. Las neuronas de retina debido a su constante exposición a la luz, su alta tasa metabólica y el alto contenido de ácidos grasos en sus membranas son muy sensibles a sufrir daño oxidativo. Este daño es el responsable de disparar procesos de apoptosis en este tejido. Muchas enfermedades neurodegenerativas de la retina involucran la muerte por apoptosis de las neuronales retinales, y tienen en común que el daño oxidativo es un desencadenante. Este estrés activa vías que involucran a las mitocondrias y conduce a la apoptosis. El conocimiento de los mecanismos por los cuales induce dicha activación es fundamental en el desarrollo de futuras estrategias terapéuticas. Trabajos previos de nuestro laboratorio demuestran que la carencia de factores tróficos durante el desarrollo neuronal in vitro y el estrés oxidativo inducido por PQ inducen la muerte por apoptosis de las neuronas fotorreceptoras. El ácido docosahexaenoico (DHA, 22:6 n-3) es un ácido graso poliinsaturado esencial de la familia de los omega 3, sintetizado a partir del ácido ɑ-linolénico (18:3 n-3) y se encuentra altamente concentrado en las células del sistema nervioso, principalmente en las membranas sinápticas y en los fotorreceptores. El DHA en el sistema nervioso desarrolla múltiples funciones, juega un papel importante en el proceso de fototransducción, en la formación de la memoria, es neuroprotector y puede regular procesos antiinflamatorios. Tradicionalmente al DHA en la retina se lo relaciona con un importante rol estructural, el de favorecer los cambios de conformación inducidos por la luz en la rodopsina, y es indispensable para el adecuado desarrollo de la visión. En nuestro laboratorio, se ha establecido un rol completamente nuevo para el DHA, el de ser un factor de supervivencia previniendo la apoptosis de los fotorreceptores por ausencia de factores tróficos durante su desarrollo in vitro y previniendo la apoptosis inducida por el oxidante Paraquat (PQ). Además hemos establecido que promueve la diferenciación de los fotorreceptores de retina de rata en cultivo. Hemos demostrado que el PQ dispara la apoptosis de las neuronas de retina en cultivo; el aumento de la apoptosis se encuentra en estrecha relación con la pérdida de integridad mitocondrial en las neuronas y se observó que los fotorreceptores son más sensibles que las neuronas amacrinas a la apoptosis inducida por PQ. El H2O2 es un agente oxidante que, a diferencia del PQ, es en sí mismo una especie oxígeno reactiva (ROS) y un mediador fisiológico del daño oxidativo en retina. En nuestro laboratorio también se demostró que el H2O2 induce un aumento de la muerte celular por apoptosis de los fotorreceptores. Es por eso que decidimos investigar en este trabajo de tesis si el DHA también puede prevenir la apoptosis disparada por H2O2, que induce la muerte de las células de retina luego de agotar los sistemas de defensa antioxidante. Para ello suplementamos cultivos neuronales de retina con o sin DHA e indujimos daño oxidativo con H2O2. Evaluamos viabilidad celular con ioduro de propidio y observamos que, al tratar a los cultivos con H2O2, en ausencia de DHA, disminuye la viabilidad celular respecto a los controles. Si previo al tratamiento con H2O2 los cultivos fueron suplementados con DHA el porcentaje de células muertas descendió a niveles comparables con los de los controles. Para determinar el efecto del DHA frente a la apoptosis inducida por H2O2 realizamos el ensayo de TUNEL y vimos un aumento de los fotorreceptores TUNEL+ en los cultivos tratados con H2O2, y una disminución de los mismos en los cultivos preincubados con DHA. Cuantificamos el porcentaje de fotorreceptores con núcleos picnóticos o fragmentados, teñidos con DAPI, para evaluar apoptosis y observamos que el H2O2 provocó un aumento de la apoptosis de los fotorreceptores respecto a los cultivos controles y que el DHA agregado previo al tratamiento con H2O2 previno la apoptosis de los fotorreceptores. Estos resultados, junto con el hecho de que el DHA protege a los fotorreceptores del daño oxidativo inducido por PQ, nos permiten concluir que el DHA es un eficaz protector de las neuronas fotorreceptoras de retina expuestas a distintos tipos de agentes oxidantes. Resultados previos de nuestro laboratorio establecieron que el DHA en cultivos neuronales de retina se incorpora a la membrana de las células, aumenta su concentración en las mismas y tiene la capacidad de activar la vía de la ERK/MAPK y regular la relación de proteínas pro y antiapoptóticas para promover la supervivencia de los fotorreceptores frente al daño oxidativo (Ger)man et al., 2006a;Rotstein et al., 2003. En este trabajo de tesis nos propusimos investigar si el DHA, además de activar las vías de supervivencia citadas, también podría estar ejerciendo su efecto protector actuando como antioxidante. Para determinar si el DHA estaría actuando como un agente antioxidante utilizamos la sonda DCFDA para medir la formación de (ROS en los cultivos y así tener una medición aproximada del daño oxidativo en los cultivos (Halliwell and Whiteman, 2004;Lu et al., 2006). Determinamos el porcentaje de fluorescencia de la sonda DCFDA oxidada respecto al control. Observamos que el porcentaje de fluorescencia aumentó al tratar los cultivos con H2O2, indicando un aumento en la formación de ROS. Observamos también que el DHA disminuyó la formación de ROS disparada por H2O2 en los cultivos neuronales de retina de rata. Para investigar si el DHA estimula enzimas del sistema de defensa antioxidante, determinamos la actividad de la GPx, que participa de la reducción de hidroperóxidos al catalizar la oxidación del Glutatión. Vimos que en cultivos suplementados con DHA previo a inducir daño oxidativo, la actividad de la enzima fue mayor que en los cultivos controles, por lo que el DHA estaría estimulando la actividad de esta enzima. Decidimos medir los niveles de sustancias reactivas con el ácido barbitúrico (TBARS) como indicador de peroxidación lipídica en los cultivos neuronales de retina tratados con H2O2. Observamos que el H2O2 aumentó los niveles de TBARS y por lo tanto la peroxidación lipídica en los cultivos neuronales de retina. Además al suplementar con DHA, independientemente de si se indujo o no estrés oxidativo con H2O2, aumentaron los niveles de TBARS respecto a cultivos sin DHA. De estos resultados se desprende que el DHA, a pesar de aumentar la peroxidación lipídica en los cultivos neuronales, promueve la supervivencia de los fotorreceptores al activar enzimas de defensa antioxidante, como la GPx, y disminuir la formación de ROS. La síntesis de DHA a partir de EPA (Acido eicosapentaenoico, 20:5 n-3) requiere de dos elongaciones que forman TPA (ácido tetracosapentaenoico, 24:5 n-3), que es posteriormente desaturado por la Δ6-desaturasa produciendo THA (ácido tetracosahexaenoico, 24:6 n-3). Finalmente este, por acción de una β-oxidasa peroxisomal, da origen al DHA. Este proceso biosintético requiere de la incorporación de los precursores desde la dieta y es principalmente llevado a cabo en el hígado. El DHA así sintetizado es luego distribuido a distintos tejidos por el sistema circulatorio. Si bien la mayor cantidad de DHA del sistema nervioso proviene de la síntesis hepática y su transporte unido a lipoproteínas de la sangre también ocurre la síntesis in situ, aunque en menor medida. Las enzimas necesarias para la síntesis de DHA están presentes en el ojo, siendo el epitelio pigmentario el sitio donde es más efectivo este proceso de síntesis. Está comprobado que este camino biosintético puede llevarse a cabo en células gliales, pero no se ha demostrado la síntesis del DHA en neuronas. En este camino metabólico el ácido eicosapentaenoico (EPA, 20:5n-3) es un intermediario, y al igual que el DHA, el EPA ha demostrado tener efectos importantes en el cerebro y retina. En retinas de rata alimentadas con dietas ricas en ácidos grasos de la serie n-3 aumenta la relación EPA/AA (EPA/Acido Araquidónico) en los segmentos externos de los fotorreceptores y disminuyen los daños a nivel de dichos segmentos externos cuando se somete a estas ratas a un daño agudo inducido por luz. Por otro lado el aumento de los niveles de EPA plasmático en pacientes humanos sanos se relaciona directamente con el aumento de la densidad del pigmento macular que regula procesos inflamatorios y previene el daño oxidativo previniendo el avance de la degeneración macular. De todos modos, aun se desconocen los mecanismos celulares y moleculares por medio de los cuales el EPA actúa como un agente neuroprotector. Como el EPA ha demostrado tener efectos muy similares a los que se observan con el DHA en diferentes modelos animales y celulares, en esta tesis investigamos si al igual que ocurre con el DHA, la suplementación de cultivos neuronales de retina con EPA es capaz de prevenir la apoptosis inducida por daño oxidativo en los fotorreceptores y promover su diferenciación. También analizamos si el EPA en neuronas de retina aisladas puede actuar como precursor metabólico del DHA, promoviendo su síntesis y si esta síntesis es indispensable para que el EPA actúe como agente neuroprotector y promotor de la diferenciación de los fotorreceptores. Para evaluar si el EPA es capaz de proteger a los FR de la apoptosis inducida por PQ, suplementamos los cultivos con EPA en concentraciones crecientes (2, 3, y 6 μM) y los tratamos con PQ. Evaluamos luego viabilidad celular, con IP y apoptosis por el estudio de la morfología nuclear con DAPI. Tanto en los cultivos controles, como en los suplementados con las distintas concentraciones de EPA se observaron porcentajes bajos de muerte celular y de fotorreceptores apoptóticos. La suplementación con EPA, previa al tratamiento con PQ previno el aumento en la mortalidad celular y en la apoptosis inducida por PQ de los fotorreceptores en una forma dosis dependiente. Determinamos que la concentración 3 μM de EPA era la más efectiva. Confirmamos el efecto protector del EPA 3 μM frente a la apoptosis inducida por PQ en los fotorreceptores utilizando el ensayo de TUNEL. El PQ indujo un aumento de los FR TUNEL + y la adición de EPA previa al tratamiento con PQ disminuyó el número de fotorreceptores TUNEL + a niveles comparables con los de los cultivos controles. Por lo tanto, el EPA, al igual que el DHA actúa como un agente protector frente a la muerte inducida por PQ en los fotorreceptores en cultivos. Esto nos llevó a plantearnos si otros ácidos grasos también podrían actuar de esta manera. Para contestarlo decidimos investigar si los ácidos araquidónico (20:4 n-6, AA), palmítico (16:0, PA) y oleico (18:1 n-9, OA) presentaban efectos antiapoptóticos frente al daño oxidativo inducido con PQ. A diferencia del EPA, ninguno de estos ácidos al ser agregados a los cultivos, evitó los procesos de muerte celular y apoptosis de fotorreceptores desencadenados por el tratamiento con PQ. Podemos afirmar entonces que sólo el EPA y el DHA disminuyen la apoptosis de los fotorreceptores inducida por PQ. Quisimos evaluar si el EPA también podría tener efecto protector frente a otro oxidante como el H2O2. El tratamiento con H2O2 provocó un marcado aumento de la apoptosis, aumentando significativamente el número de fotorreceptores con núcleos picnóticos y mitocondrias despolarizadas. La suplementación de los cultivos con EPA previo al tratamiento con H2O2 previno el aumento del número de fotorreceptores con núcleos picnóticos o fragmentados y mantuvo intacto el potencial de membrana mitocondrial en la mayoría de los fotorreceptores, al igual que en los controles. Estos resultados demuestran el rol protector del EPA frente a la apoptosis inducida por distintos tipo de daño oxidativo inducido a los fotorreceptores en cultivo. Resultados anteriores de nuestro laboratorio establecieron que in vitro, debido a la carencia de factores tróficos, la diferenciación de los fotorreceptores está restringida y en nuestros cultivos, los fotorreceptores, presentan morfología característica de fotorreceptores no diferenciados. El DHA estimula la diferenciación de los fotorreceptores. En este trabajo quisimos ver si el EPA jugaba algún rol en la diferenciación de los fotorreceptores en cultivo. Establecimos que la adición de EPA provocó un aumento de la expresión de opsina en los fotorreceptores y promovió el crecimiento de procesos apicales, rudimentos de los segmentos externos. Por lo que el EPA estimula la diferenciación de los fotorreceptores durante el desarrollo en cultivo. También nos propusimos evaluar si el EPA es capaz de modificar la composición de ácidos grasos de los fosfolípidos de la retina neural. El análisis por GLC de la composición de ácidos grasos de los cultivos neuronales reveló valores de EPA muy bajos en los cultivos controles. Sorprendentemente, no existió una acumulación significativa de este ácido graso en los fosfolípidos luego de la incubación con EPA pero que sí se duplicaron los niveles de DHA. Esto nos llevó a suponer que los fotorreceptores y/o neuronas amacrinas en nuestros cultivos eran capaces de elongar y desaturar al EPA para producir DHA. Para que este proceso metabólico pueda llevarse a cabo es clave la presencia de la enzima Δ6 desaturasa, responsable de la transformación del TPA al THA. Investigamos por técnicas inmunocitoquimicas y western blot si esta enzima se expresa en los cultivos neuronales de retina. El western blot reveló la expresión de la enzima en los cultivos neuronales de retina. La citoquímica mostró que la enzima estaba presente tanto en el citoplasma como en los núcleos de los fotorreceptores y las células amacrinas. Estos resultados demuestran, por primera vez, que las neuronas de retina son capaces de sintetizar DHA a partir de EPA como precursor. El hecho de que el EPA en nuestros cultivos esté promoviendo la síntesis de DHA sumado a que los efectos que presenta son los mismos que se vieron con anterioridad por parte del DHA, nos llevó a plantearnos la hipótesis de que este ácido graso no estuviera actuando por sí mismo, sino como consecuencia de su metabolización a DHA. Para respondernos este interrogante, preincubamos a los cultivos con CP24879 (CP), un inhibidor de las Δ5 y Δ6 desaturasas, antes de suplementarlos con EPA. Como era de esperar, la presencia del inhibidor previno el aumento de los niveles de DHA y condujo a un aumento del contenido de DPA en los cultivos suplementados con EPA. Evaluamos el efecto del agregado de CP sobre la protección del EPA frente al tratamiento con H2O2. El agregado de CP bloqueó por completo el efecto protector del EPA frente a la apoptosis inducida por H2O2, y el porcentaje de fotorreceptores apoptóticos fue el mismo que el que observamos en los cultivos tratados con H2O2 sin EPA. También analizamos si la síntesis de DHA era necesaria para promover la diferenciación de los fotorreceptores. Para ello, investigamos si la incubación con CP afectaba al aumento en la expresión de opsina que provoca el EPA en los cultivos neuronales. El EPA provocó un aumento en la cantidad de fotorreceptores que expresaron opsina, pero la incubación previa con CP bloqueó este efecto y la cantidad de fotorreceptores opsina + en estos cultivos fue comparable con la que observamos en los cultivos controles. Por lo tanto estos resultados indican que la adición de EPA a los cultivos neuronales de retina previene la apoptosis de los fotorreceptores expuestos a condiciones de estrés oxidativo y estimula el avance de la diferenciación de las neuronas fotorreceptoras. También demuestran que al inhibir la actividad de la Δ6 desaturasa, enzima que cataliza la reacción requerida para la síntesis de DHA a partir de EPA, se bloquean los efectos del EPA sobre los fotorreceptores. Esto implica que no es el EPA en sí mismo el que previene la apoptosis y favorece la diferenciación de los FR en cultivo, sino que es el DHA sintetizado a partir del EPA En resumen, las conclusiones más destacadas de este trabajo de tesis son las siguientes:  El DHA previene la muerte por apoptosis inducida por H2O2 de los fotorreceptores en cultivo.  El DHA frena la formación de ROS inducida por H2O2  El agregado de DHA aumenta los niveles de peroxidación lipídica en los cultivos neuronales de retina.  El DHA activa enzimas que participan de los mecanismos de defensas antioxidantes para prevenir la formación de ROS que estimula el H2O2.  El agregado de EPA, y no de otros ácidos grasos, previene la apoptosis inducida por PQ y H2O2, efecto que son comparables al observados al suplementar los cultivos con DHA.  El agregado de EPA promueve la diferenciación de los fotorreceptores durante el desarrollo in vitro, aumentando los niveles de expresión de opsina y la formación de procesos apicales.  Los fotorreceptores de rata en cultivo expresan Δ6 desaturasa, esencial para la síntesis de DHA.  Las neuronas de retina de rata en cultivo son capaces de sintetizar DHA a partir de EPA.  El EPA debe ser metabolizado a DHA para proteger a los fotorreceptores de la apoptosis inducida por estrés oxidativo y para promover la diferenciación de los mismos. / The neural retina is the tissue in the back of the eye. In vertebrates it consists of five types of neurons: photoreceptor (rods and cones), amacrine, horizontal, ganglion, and bipolar neurons. The retina is the most studied neural structure because its different cell types are arranged to form a highly structured tissue, and due to its relative simplicity, and its accessibility, and has been widely used as a model for studying the central nervous system. Due to their constant exposure to light, high metabolic rate and high content of fatty acids in their membranes retinal neurons are very sensitive to oxidative damage. This damage is responsible for triggering apoptosis in this tissue. Many neurodegenerative retinal diseases have in common the apoptotic death of retinal neuronal and that oxidative damage acts as a trigger of this death. This stress-activated pathway involving mitochondria leads to apoptosis. Knowledge of the mechanisms by which this activation is induced is critical in the development of future therapeutical strategies. Previous work from our laboratory has shown that the absence of trophic factors during neuronal development in vitro and induction of oxidative stress by paraquat (PQ) treatment leads to the apoptotic death of photoreceptor neurons. Docosahexaenoic acid (DHA, 22:6-3) is a polyunsaturated fatty acid of the omega-3 family, synthesized from linolenic acid (18:3 n-3) and is highly concentrated in the cells of the nervous system, especially in synaptic membranes and in photoreceptors. DHA plays multiple functions in the nervous system; it has an important role in the phototransduction process, in the formation of memory, it is neuroprotective and it can regulate inflammatory processes. Traditionally, DHA in the retina has been related to an important structural role, favoring the conformational changes induced by light in rhodopsin, and it is known to be essential for proper development of vision. In our lab, we have established a completely new role for DHA, that of being a survival factor preventing apoptosis of photoreceptors in the absence of trophic factors during in vitro development. We have also established that it promotes differentiation of rat retinal photoreceptors. We have also shown that the oxidant paraquat (PQ) triggers apoptosis of retina neurons in culture, the increase in apoptosis being closely related to the loss of mitochondrial integrity. We demonstrated that photoreceptors are more sensitive than amacrine neurons to PQ-induced apoptosis. H2O2 is an oxidizing agent that, unlike PQ, is in itself a ROS (Reactive oxygen species) and a physiological mediator of oxidative damage in the retina. In our laboratory we demonstrated that H2O2 induces apoptosis of photoreceptors. In this Thesis we investigated if DHA can also prevent H2O2-induced apoptosis after exhausting the retinal antioxidant defense systems. To do this we supplemented retina neuronal cultures with or without DHA and we induced oxidative stress with H2O2. We assessed cell viability with propidium iodide and observed that treatment of cultures with H2O2 in the absence of DHA decreased cell viability relative to controls. If cultures were supplemented with DHA previous to H2O2 treatment, the percentage of dead cells decreased to levels comparable to those found in controls. To determine the efficacy of DHA to prevent apoptosis induced by H2O2 we evaluated apoptosis with the TUNEL assay and established that H2O2 treatment increased TUNEL + photoreceptors, while they were decreased in cultures preincubated with DHA. To evaluate apoptosis we quantified the percentage of photoreceptors showing fragmented or pyknotic nuclei by staining nuclei with DAPI and observed that H2O2 treatment increased apoptosis of photoreceptor compared to controls and pretreatment with DHA prevented H2O2-induced apoptosis of photoreceptors. These results, together with the fact that DHA protects photoreceptors from oxidative damage induced by PQ, allow us to conclude that DHA is an effective protector of retinal neurons exposed to various types of oxidizing agents. Previous results from our laboratory have established that DHA added to retinal neuronal cultures is incorporated into cell membranes, increasing its levels in neuronal lipids, activating the ERK / MAPK pathway and regulating the ratio of pro to anti-apoptotic proteins, thus promoting photoreceptor survival upon oxidative damage. In this Thesis we investigated whether DHA could also be exerting its protective effect by acting as an antioxidant. To evaluate this we used the DCFDA probe to measure the formation of ROS in culture and get a rough measure of oxidative damage. We determined the percentage of the DCFDA fluorescence probe oxidized over control and established that the percentage of fluorescence increased by treating the cultures with H2O2, indicating an increase in ROS formation. We also showed that DHA decreased ROS formation triggered by H2O2 in neuronal cultures of rat retina. To investigate whether DHA stimulates enzymes from the antioxidant defense system, we determined the activity of glutathione peroxidase (GPx), which participates in the reduction of hydroperoxides by catalyzing the oxidation of GSH. We established that in cultures supplemented with DHA previous to the induction of oxidative damage the enzimatic activity was higher than in control cultures, suggesting DHA stimulates the activity of this enzyme . We measured the levels of TBARS as an indicator of lipid peroxidation in neuronal cultures treated with H2O2. We observed that H2O2 increased TBARS levels and therefore lipid peroxidation in retinal neuronal cultures. DHA supplementation caused an increase in TBARS levels compared to cultures without DHA, both in the presence or the absence of oxidative damage. From these results it is apparent that DHA, in spite of the increase it triggers in lipid peroxidation in neuronal cultures, promotes photoreceptor survival by activating antioxidant defense enzymes such as GPx, and reducing the formation of ROS. DHA synthesis from EPA (eicosapentaenoic acid, 20::5 n-3) requires two elongations that form TPA (tetracosapentaenoic acid, 24:5 n-3), which is subsequently desaturated by the Δ6-desaturase producing THA (24:6 n-3, tetracosahexaenoic acid). Finally THA is decarboxylated to DHA by a peroxisomal β-oxidase. This biosynthetic pathway requires the provision of precursors in the diet and is mainly carried out in the liver. DHA is then distributed to various tissues through the circulatory system. While most of the DHA in the nervous system comes from the hepatic synthesis and lipoprotein transport of blood, in situ synthesis also occurs though to a lesser extent. The enzymes necessary for the synthesis of DHA are present in the eye and its synthesis is more effective in retinal pigment epithelium than in the retina. It has been shown that this biosynthetic pathway can be carried out in glial cells, but it is still unknown whether this synthesis occurs in neurons. In this metabolic pathway EPA is an intermediate, and like DHA, it has been shown to have significant effects on the brain and retina. In rats fed diets rich in fatty acids of the n- 3 series, the EPA/AA (EPA /arachidonic acid) ratio increases in the outer segments of photoreceptors and the damage to these outer segments is reduced when rats are subjected to acute light-induced damage. Moreover, increased levels of EPA in plasma of healthy human patients are directly related to increased macular pigment density, which regulates inflammatory response, and prevents oxidative damage and the progression of macular degeneration. However, the molecular and cellular mechanisms by which EPA acts as a neuroprotective agent are still unknown. As EPA has demonstrated effects very similar to those observed with DHA in different animal and cellular models, here we investigated whether EPA was able to prevent apoptosis of photoreceptors induced by oxidative damage and promote their differentiation. We also investigated if EPA acted as a metabolic precursor of DHA in retina neurons, promoting its synthesis and if this synthesis was essential for EPA effects in photoreceptors. To assess whether EPA is able to protect photoreceptors from PQ-induced apoptosis, we supplemented cultures with increasing concentrations of EPA (2, 3, and 6 μM) and treated them with PQ. Then we evaluated cell viability with PI, and studied apoptosis by DAPI staining. Low percentages of cell death and apoptotic photoreceptors were observed both in control cultures and in those supplemented with different concentrations of EPA. Supplementation with EPA prevented the increased in cell death and apoptosis induced by PQ in a dose dependent manner. We determined that the 3 uM EPA concentration is the most effective. We confirmed the protective effect of 3 μM EPA from apoptosis induced by PQ in photoreceptors by TUNEL assay. PQ induced an increase in TUNEL + photoreceptors and EPA addition prior to treatment with PQ decreased the number of TUNEL + photoreceptors to levels comparable with control cultures. Therefore, the EPA, like DHA acts as a protective agent against PQ-induced death in photoreceptors in culture. This led us to ask whether other fatty acids might also act in this way. To answer this we decided to investigate whether arachidonic acid (20:4 n-6, AA), palmitic (16:0 PA) and oleic (18:1 n- 9) acids had antiapoptotic effects against oxidative damage induced by PQ. Unlike EPA or DHA, none of these fatty acids when added to the cultures prevented cell death and photoreceptor apoptosis triggered by PQ. We can propose that only EPA and DHA decreased photoreceptor apoptosis induced by PQ. We wanted to assess whether EPA was also protective against other oxidants such as H2O2.Treatment with H2O2 caused a marked increase in apoptosis, significantly increasing the number of photoreceptors with pyknotic nuclei and depolarized mitochondria. Supplementation of the cultures with EPA prior to treatment with H2O2 prevented the increase in the amount of photoreceptors with fragmented or pyknotic nuclei and retained mitochondrial membrane potential in most photoreceptors, with values similar to control cultures. These results demonstrate the protective role of EPA from apoptosis induced by different types of induced oxidative damage to photoreceptors in culture. Previous results from our laboratory have established that in vitro, due to lack of trophic factors, differentiation of photoreceptors is restricted and in our cultures, photoreceptors exhibit an undifferentiated morphology. DHA stimulates photoreceptors differentiation. In this study we investigated whether EPA played a role in the differentiation of photoreceptors in culture. We established that EPA addition promoted an increase in opsin expression in photoreceptors and promoted the development of apical processes. EPA therefore stimulates the differentiation of photoreceptors during development in culture. We also set out to assess whether EPA was able to modify the fatty acid composition of phospholipids of cultured neurons. GLC analysis of fatty acid composition of the cultured neurons revealed very low levels of EPA in control cultures. Surprisingly, there was no significant accumulation of this fatty acid in phospholipids after incubation with EPA but DHA levels were doubled. This led us to presume that photoreceptors or amacrine neurons in our cultures were able to elongate and desaturate EPA to produce DHA. Δ6-desaturase enzyme is a key enzyme in this process. It is responsible for the transformation of TPA to THA. We investigated by Western blot and immunocytochemical techniques if this enzyme was expressed in the retinal neuronal cultures. Western blot analysis revealed the expression of the enzyme in retinal neurons. Cytochemistry showed that the enzyme was present in both the cytoplasm and nuclei of photoreceptors and amacrine neurons. These results demonstrate, for the first time, that retinal neurons are able to synthesize DHA using EPA as a precursor. The fact that EPA addition leads to DHA synthesis together with the evidence that its effects were the same as those shown for DHA, led us to consider the hypothesis that this fatty acid was not acting by itself, but rather due to its metabolization to DHA. To answer this question, cultures were preincubated with CP24879 (CP), a Δ5 and Δ6-desaturase inhibitor before supplementation with EPA. As expected, the presence of the inhibitor prevented the increase in DHA levels in spite of EPA addition and showed a tendency to increase the levels of DPA in cultures supplemented with EPA. We evaluated the effect of the addition of CP on EPA neuroprotection. The addition of CP completely blocked the protective effect of EPA against H2O2-induced apoptosis, and the percentage of apoptotic photoreceptors was the same as that observed in cultures treated with H2O2 without EPA. We also analyzed whether DHA synthesis is required to promote photoreceptors differentiation. For this, we investigated whether incubation with CP affected EPA-induced increase in opsin expression in neuronal cultures. EPA caused an increase in the amount of opsin expression, but preincubation with CP blocked this effect and the amount of opsin + photoreceptors in these cultures was comparable to that observed in controls. Therefore these results indicated that EPA addition to retina neuronal cultures prevented apoptosis of photoreceptors exposed to conditions of oxidative stress and stimulated the differentiation of photoreceptors. EPA effects on photoreceptors were blocked when Δ6-desaturase was inhibited. This implies that it is not EPA by itself that prevents apoptosis and promotes differentiation of cultured photoreceptor but it is DHA synthesized from EPA the fatty acid responsible for these effects. In summary, the main conclusions of this thesis are: - DHA prevents H2O2- induced apoptosis of photoreceptors -DHA decreases the formation of ROS induced by H2O2 - DHA increases the levels of lipid peroxidation in neural retina cultures - DHA activates enzymes involved in the antioxidant defense mechanisms to prevent ROS formation stimulating H2O2 - EPA, like DHA, prevents oxidative stress-induced apoptosis - EPA and not other fatty acids, prevents PQ-induced apoptosis - EPA promotes differentiation of photoreceptors during development in vitro, increasing opsin expression and the formation of apical processes - Cultured rat photoreceptors express Δ6-desaturase - Rat retinal neurons in culture are able to synthesize DHA from EPA - EPA must be metabolized to DHA to protect photoreceptors from apoptosis induced by oxidative stress and for promoting their differentiation.

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La retina es un tejido sensible a la luz que recubre la superficie interna del ojo. La complejidad estructural y funcional de la retina hacen de este tejido uno de los más vulnerables a alteraciones provocadas por todo tipo de lesión o enfermedad. Las enfermedades del sistema visual conllevan para los sujetos afectados una mengua en la calidad de vida. Entre las enfermedades degenerativas de tipo genético del sistema visual, la retinosis pigmentaria (RP) es una de las más importantes por incidencia y porque al día de hoy no existe terapia curativa efectiva. La RP comprende un conjunto de enfermedades neurodegenerativas de la retina que afectan principalmente a los fotorreceptores, produciendo una pérdida gradual de la visión y desembocando paulatinamente en ceguera. Sin embargo, son varias las alternativas terapéuticas que se están investigando en la actualidad con el fin curar la enfermedad. La terapia génica, las células encapsuladas, la optogenética, el trasplante de células madre y, por último, los chips electrónicos, son estrategias con un futuro esperanzador en la curación de la enfermedad. Mientras tanto, con el objetivo de retardar la evolución de la enfermedad y la degeneración del sistema visual, se ha planteado estudiar otros posibles tratamientos que puedan retrasar la evolución de la RP y mejorar la calidad de vida de los sujetos afectados. La investigación en los últimos 20 años, gracias a las nuevas tecnologías disponibles, ha demostrado que las sustancias antiapoptóticas, antioxidantes, factores tróficos y neuroprotectores influencian la degeneración retiniana. El presente trabajo persigue estudiar 2 sustancias, una de origen natural y otra sintética, con el objetivo de encontrar agentes capaces de enlentecer el decurso degenerativo de la retina en el modelo murino de retinosis pigmentaria P23H, siempre teniendo en cuenta la inquietud de encontrar un tratamiento terapéutico aplicable a seres humanos en el futuro. El objetivo de este trabajo es determinar el posible potencial terapéutico, en tratamiento crónico, de las sustancias elegidas. El Cannabinoide sintético HU210 podría retrasar o prevenir la degeneración y la muerte de los fotorreceptores y del entramado sináptico de la retina. En anteriores estudios publicados, HU210 protege las células neuronales en varias enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y el estrés isquémico. Además, se han descrito efectos sobre la reducción de la presión intraocular en relación con el glaucoma. La nicotina podría retrasar o prevenir la degeneración y la muerte de los fotorreceptores y otras neuronas de la retina, actuando sobre los receptores nicotínicos. En este caso la bibliografía es un poco más escasa y ambigua, pero quisimos comprobar si la suministración crónica de nicotina podría tener algún efecto positivo sobre el transcurso de la enfermedad retiniana. La eficacia de los tratamientos fue evaluada mediante registros electrorretinográficos, con objeto de medir la actividad funcional de la retina. También se utilizaron métodos de inmunohistoquímica con el objetivo de caracterizar los efectos de HU210 sobre la morfología y conectividad sináptica de la retina. A la vez, evaluamos eventuales efectos de HU210 sobre el peso, apetito y consumo de agua de los animales objeto de investigación. Se espera con estos estudios esclarecer el posible potencial terapéutico de estas sustancias. Este trabajo se ha realizado sobre ratas de la línea P23H-3, pero todos los resultados esperamos sean, con el tiempo necesario, aplicables a seres humanos afectados por la RP.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-03-21T14:27:41Z No. of bitstreams: 1 2012_RodrigoAlmeidaVieiraSantos.pdf: 10078770 bytes, checksum: a6ef3d8f96645b7bccb97e04db13fda2 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-03-22T12:13:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_RodrigoAlmeidaVieiraSantos.pdf: 10078770 bytes, checksum: a6ef3d8f96645b7bccb97e04db13fda2 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-22T12:13:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_RodrigoAlmeidaVieiraSantos.pdf: 10078770 bytes, checksum: a6ef3d8f96645b7bccb97e04db13fda2 (MD5) / INTRODUÇÃO: A Vitreorretinopatia proliferativa (VRP) continua a ser a principal causa de redescolamento da retina e da cegueira após descolamento da retina, tendo seu local habitual de proliferação e redescolamento o quadrante inferior. Assim, existe a necessidade de se buscar um substituto vítreo que seja adequado para uso, durante um período limitado, no pós1operatório. Este agente tamponante deve ser mais pesado que a água, mais leve que o perfluorocarbono líquido e compatível com o olho para curto ou longo prazo. OBJETIVOS: Avaliar o decafluoro-di-n-pentil (DFPE) como tamponante vítreo examinando a tolerância ocular, através de exame clínico, eletrorretinográfico e histológico em olhos de coelhos albinos. DESENHO: experimental e prospectivo. MÉTODOS: Treze coelhos machos, albinos, da raça Nova Zelândia foram divididos em quatro grupos e submetidos a vitrectomia mecânica: Grupo 1– DFPE (0,8 a 1,0ml) foi injetado em um olho de quatro coelhos, acompanhados por seis meses; Grupo 2– DFPE (0,8 a 1,5ml) foi injetado em um olho de quatro coelhos, acompanhados por 12 meses; Grupo 3– foi injetado uma mistura de DFPE (1,0ml) e óleo de silicone (OS)(0,2ml) 5000 centistokes em um olho de três coelhos, acompanhados por seis meses; e Grupo 4– solução salina balanceada (SSB) foi injetado em um olho de dois coelhos e acompanhados por 12 meses, servindo como controle operado em conjunto com o olho não operado de cada grupo. Avaliação pós-operatória incluiu inspeção do segmento anterior, tonometria, oftalmoscopia binocular indireta e eletrorretinograma (ERG) escotópico. Após 1 mês de remoção do DFPE e OS, outro ERG foi realizado em cada grupo antes da enucleação e análise histológica. RESULTADOS: Clinicamente, nos grupos 1, 2 e 3, o líquido ocupou a porção inferior da cavidade vítrea. As gotas menores foram observadas gradualmente, e o líquido gerou pouca inflamação na cavidade vítrea. A dispersão do líquido apareceu 2 semanas após a cirurgia e para o restante do acompanhamento, o tamanho da gota permaneceu estável. Catarata subcapsular posterior apareceu nos olhos com as quantidades grandes de DFPE (> 50%). Os restos celulares foram observados entre os grupos com DFPE e solução salina balanceada (SSB) em 6 de 8 olhos, permanecendo estável até o fim do estudo. Os achados histológicos nos grupos 1 e 2 não mostraram nenhuma mudança detectável na espessura da camada nuclear externa, mas a saída ocasional de núcleos da camada de fotorreceptores ocorreu na retina inferior. Espessamento da retina interna foi observado também inferiormente. A retina interna ficou bem preservada nos grupos 1, 2 e 3. O ERG dos grupos 1, 2 e 3 não apresentou alteração no tempo de culminação da onda a e onda b, mas a amplitude da onda b mostrou-se elevada (p< 0,001) até o 6° mês de seguimento, não apresentando significância estatística (p>0,05) até o final do estudo quando comparado com o grupo controle. CONCLUSÕES: Decafluoro-di-n-pentil demonstrou o mínimo de efeitos adversos na retina dos coelhos, porém estudos adicionais são necessários antes de uso clínico como agente tamponante. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / BACKGROUND: Proliferative vitreo1retinopathy (PVR) continues to be the primary cause of retinal redetachment. The usual site of proliferation and redetachment is the inferior retina. The hypothesis regarding intraocular liquid perfluorochemical use is that it would be suitable as internal tamponade for a limited period of time. PURPOSE: To evaluate decafluoro-di-n-pentyl ether (DFPE), a liquid perfluorochemical, as a temporary vitreous tamponade by examining ocular tolerance through clinical, histological and electroretinographic examination, in rabbits’ eyes. DESIGN: Prospective, experimental. METHODS: Thirteen New Zealand white males rabbits were divided into four groups after mechanical vitrectomy. Group 1 – DFPE (0.8 to 1.0 ml) was injected in one eye of four rabbits, and were followed for six months after surgery; group 2 - DFPE (0.8 to 1.5 ml) was injected in one eye of four rabbits, and were followed for twelve months; group 3 - a mixture of DFPE (1.0 ml) and silicone oil (0.2 ml) 5000 centistokes was injected in one eye of three rabbits, and were followed for six months, and group 4 - balanced salt solution (BSS) was injected in one eye of two rabbits, and were followed for up 12 months that served as an operated control group in conjunction with the unoperated eye of each group. Postoperative clinical evaluation included inspection of the anterior segment, tonometry, indirect binocular ophthalmoscopy and scotopic electroretinogram test (ERG). Following 1 month of DFPE and silicone oil (SiO) removal, another ERG test was performed in each group before the eyes were enucleated and processed for histological evaluation. RESULTS: Clinically, on groups 1, 2 and 3, the liquid occupied the inferior portion of the vitreous cavity. Smaller droplets were gradually observed, and the liquid appeared to be well tolerated with little vitreous inflammation. Dispersion of the fluid appeared 2 weeks postoperatively and for the remainder of follow- up, globule size remained stable. Posterior subcapsular cataracts appeared in eyes with large fills of DFPE (> 50%). Cellular debris was observed at the interface between DFPE and physiological fluid in 6 of 8 DFPE1injected eyes and this remained unchanged until the end of study. Histological findings on group 1 and 2 showed no detectable change in outer nuclear layer thickness, but occasional dropout of photoreceptor cell nuclei occurred in inferior retina. Thickening of the inner retina was also noted inferiorly. Foam cells were observed in the vitreous and on the surface of the retina. Except for some vacuolations, the inner retina was well preserved in all DFPE and DFPE + SiO- injected eyes. Penetration of the liquid into the inner retina was not seen. On the ERG of DFPE and DFPE + SiO-injected eyes, there was no effect on the a-wave amplitude and b-wave implicit time, but the b-wave amplitude was elevated with statistical significance (p<0.001) at 1, 3 and 6 months postoperatively. On the other hand, there was no statistical difference (p>0.05) at 12 months of follow up and 1 month after DFPE removal when compared with group 4 and unoperated fellow eyes of each group. CONCLUSIONS: Decafluoro-di-n-pentyl ether demonstrated minimum adverse effects in retinal rabbits, and therefore appears to be suitable for intraoperative use and short1term vitreous tamponade.

Los fotorreceptores (FRs) son las neuronas que capturan la luz en el ojo, por lo que juegan un rol central en la visión. La pérdida progresiva de estas células durante ciertas enfermedades neurodegenerativas de la retina, como la retinitis pigmentosa o la degeneración macular, conduce a déficits de la visión y eventualmente a la ceguera. Estas patologías, así como otras que afectan al sistema nervioso central, están caracterizadas por la degeneración gradual, selectiva e irreversible de una población neuronal específica. La deficiencia de factores tróficos ha sido involucrada en muchos de estos procesos neurodegenerativos y es característica de la denominada muerte celular programada, tal como la que ocurre al momento de la sinaptogénesis en el desarrollo del sistema nervioso. En efecto, en la retina, así como también en otras partes del sistema nervioso, las neuronas requieren para su supervivencia, de factores tróficos, los cuales provienen de su entorno. El requerimiento de factores tróficos varía según el tipo celular y la etapa del desarrollo. En particular, para los FRs ya se han identificado varios de ellos, incluyendo el Factor Neurotrófico Derivado de la Glía (GDNF), el Factor Neutrófico Ciliar (CNTF), el Factor de Crecimiento Fibroblástico (FGF), el ácido docosahexaenoico (DHA), la esfingosina 1-fosfato (S1P) y, más recientemente, uno de los principales, el Factor Derivado del Epitelio Pigmentario (PEDF), una proteína con funciones neurotróficas y antiangiogénicas, asociadas a dominios separados de la proteína. La identificación de las secuencias de estos dominios ha permitido diseñar y sintetizar químicamente péptidos estables, como los fragmentos neurotróficos 44-mer y 17-mer, que conservan las propiedades de la proteína nativa y, por ende, de potencial valor médico. Sin embargo, estas características ventajosas requieren ser evaluadas en un modelo experimental adecuado. La mayoría del conocimiento actual sobre el PEDF se ha obtenido gracias a modelos in vivo, donde, debido su inherente complejidad, sumado a la cantidad de interacciones que ocurren entre las células y moléculas de tejidos circundantes, resulta difícil analizar los procesos involucrados. Una alternativa a este obstáculo son los cultivos primarios elegidos para realizar esta tesis, compuestos solo de neuronas amacrinas y FRs, las que, creciendo en medios químicamente definidos, permiten estudiarlas en un entorno mucho más controlado que en el organismo entero. En estos cultivos, los FRs se desarrollan independientemente, sin requerir la suplementación de factores tróficos, pero, una vez establecidas sus conexiones sinápticas, se tornan dependientes de los mismos para continuar con su desarrollo y prolongar supervivencia. La dependencia por estos factores hace de este sistema in vitro un modelo adecuado para evaluar el efecto de distintas moléculas sobre la supervivencia o diferenciación celular. Por ello, los resultados reseñados en el primer capítulo de esta tesis tuvieron como objetivo principal evaluar el efecto de PEDF y los péptidos derivados de su dominio neurotrófico y angiogénico en este modelo de cultivo primario de neuronas de retina. En estos cultivos, tanto los FRs como las neuronas amacrinas exhibieron el receptor de PEDF (PEDF-R), el cual es una fosfolipasa del tipo A2, localizado principalmente en la membrana celular. Por otro lado, la expresión del transcripto para PEDF-R mostró un patrón decreciente durante los primeros 5 días de cultivo, así como también en la retina in vivo, en el mismo periodo de desarrollo. Este patrón se observó también a nivel de la proteína, aunque su descenso en el tiempo fue más atenuado. Tanto el PEDF como los dos péptidos derivados de su dominio neurotrófico, protegieron a los FRs en cultivo de la muerte celular, caracterizada por ensayos de TUNEL y Anexina V. Además, previnieron la pérdida de la función mitocondrial evaluada mediante Mitotracker, y preservaron la integridad estructural de la membrana plasmática, analizada indirectamente por medio de ioduro de propidio y DAPI; dado que estos marcadores se visualizan una vez que se altera la permeabilidad de la membrana plasmática. Esta protección se debió principalmente a la interacción de PEDF con PEDF-R, y, en parte, al aumento constatado en la transcripción de factores antiapoptóticos como Bcl2 y Bcl2a1. El efecto del PEDF fue específico para la supervivencia de los FRs dado que el mismo no alteró la viabilidad de las neuronas amacrinas, la cual se mantuvo constante durante los días de cultivo analizados. Por el contrario, el PEDF y los péptidos 44-mer y 17-mer promovieron el desarrollo de neuritas en las neuronas amacrinas, e indujeron la diferenciación de los FRs, al promover la polarización de la rodopsina hacia el extremo apical de estas neuronas, tal como ocurre en los FRs maduros de la retina in vivo. Estos efectos fueron anulados eficientemente mediante el secuestro de PEDF o de sus péptidos por medio del péptido bloqueante P1, o por la inhibición de la actividad enzimática del PEDF-R mediante el inhibidor enzimático selectivo atglistatin. Todos los efectos del PEDF y sus péptidos neurotróficos fueron asociados a la interacción de los mismos con el PEDF-R. Por su parte, el fragmento derivado del dominio antiangiogénico del PEDF no tuvo ningún efecto. Por otro lado, también se indagó sobre el potencial del epitelio pigmentario de la retina (EPR) derivado de células madre pluripotentes (CMP) en la producción y liberación del PEDF. Dado que la deficiencia del PEDF ha sido correlacionada con una mayor incidencia de ciertas retinopatías y el hecho que el EPR puede estar comprometido en algunas de estas patologías, ha impulsado el desarrollo de estrategias orientadas a reemplazar el EPR dañado. Entre ellas se destaca la estrategia de generar EPR por medio de CMP obtenidas a partir de la inducción de células somáticas mediante la transducción de factores de pluripotencia por medio de un sistema episomal. Este tipo de estrategia requiere sortear múltiples obstáculos antes de ser viable, particularmente el de garantizar la identidad del nuevo EPR. El objetivo de esta línea de investigación, descripta en el segundo capítulo de esta tesis, fue evaluar los aspectos funcionales del EPR derivado de células madre, comparándolos con los del EPR nativo. El EPR derivado de CMP humanas recapituló las características distintivas del EPR nativo, como la polarización baso-apical, la capacidad de fagocitar y metabolizar segmentos externos de FRs y la producción de PEDF. Todas estas características se mantuvieron aun hasta 50 días después de su inducción, con la producción de PEDF incrementándose significativamente en función del tiempo. En conclusión, el PEDF y los péptidos derivados de su dominio neurotrófico ejercieron efectos citoprotectores y de diferenciación sobre los fotorreceptores y promovieron el crecimiento de neuritas en las neuronas amacrinas. Todos estos efectos fueron dependientes de la interacción entre PEDF y PEDF- R. Por otro lado, el EPR derivado de CMP examinado en este trabajo de tesis mostró un comportamiento similar al del EPR en la retina intacta, lo que permite considerar sus posibles capacidades terapéuticas para estas enfermedades / Photoreceptors (PHRs) are the retinal neurons, which react to light, making them a central component in the visual process. Their loss during certain retinal neurodegenerative diseases, such as retinitis pigmentosa or age-related macular degeneration, leads to a gradual decline of vision and ultimately to blindness. These pathologies, as well as others that target the central nervous system, are characterized by the gradual, selective and irreversible degeneration of specific neuronal cell types. The lack of trophic factors has been involved in many of these neurodegenerative processes and it is characteristic of the so- called programmed cell death, such as the one that occurs during the period of synaptogenesis within the developing nervous system. In the retina, just as any other portions of the nervous system, neurons are dependent on trophic factors, which are produced by their environment. Trophic factor requirements vary according to each cell type and its developmental stage. For the PHRs, many trophic factors have been already identified, including the Glial cell line-derived Neurotrophic Factor (GDNF), Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF), Fibroblastic Growth Factor (FGF), docosahexaenoic acid (DHA), sphingosine-1-phosphate (S1P) and, perhaps one of the most important among them, the Pigment Epitheliumderived Factor (PEDF). PEDF is a protein exhibiting both neurotrophic and antiangiogenic properties, which are conferred by two spatially-separated domains of the PEDF polypeptide. The identification of the sequences of these domains has allowed for the design and chemical synthesis of stable peptides, such as the neurotrophic fragments 44-mer and 17-mer, which could potentially retain the neurotrophic properties of the native protein, and therefore having a potential therapeutic value. However, these advantages should be first evaluated on an adequate experimental model. Up to now, most of our knowledge regarding PEDF has been obtained through in vivo models, which, due to their inherent complexity and the multiplicity of interactions between cells and their surrounding tissues, makes it difficult to analyze the specific processes occurring at a smaller scale. An alternative to overcome these limitations is the use of primary cultures chosen for the present thesis, composed solely of PHRs and amacrine neurons cultured in a chemically defined medium. These cultures allow the study of these neurons in a much more controlled environment when compared to a whole organism. PHRs in these cultures, initially develop and replicate without requiring trophic factor supplementation, but once they establish their synaptic connections, become reliant on them for their survival. This reliance makes this in vitro system an adequate testbed to evaluate the effects of different trophic factors on cell survival and differentiation. Therefore, the results of the first part of the thesis, which are shown in the first chapter, have the main objective of evaluating the effects of PEDF and peptides derived from its neurotrophic and antiangiogenic domains in a primary retinal cell culture-based model. In these cultures, both neuronal types exhibited the PEDF receptor (PEDF-R), which was primarily localized in the cell membrane. Additionally, the expression patterns for the PEDF-R transcript showed a decreasing trend on the first 5 days in culture, which was also observed in the in vivo environment. This pattern was also observed at the protein level, albeit in a less dramatic fashion. PEDF as well as its neurotrophic domain-derived peptides protected cultured PHRs from cell death, which was measured by TUNEL and Annexin V assays. Furthermore, they also prevented the loss of mitochondrial function, as evaluated by Mitotracker, and preserved the structural integrity of the plasma membrane analyzed by propidium iodide and DAPI staining, given that these markers are visualized once the plasma membrane permeability is altered. This protection was exerted through PEDF/PEDF-R interaction, along with the upregulation of antiapoptotic factors such as Bcl2 and Bcl2a1. This protective effect was PHR-specific, given that there was no significant difference in the survival rate of amacrine neurons, which was constant throughout the observed timeframe. Furthermore, PEDF and the 44-mer and 17-mer peptides promoted neurite outgrowth in amacrine neurons and induced PHR differentiation by promoting apical rhodopsin polarization, mimicking the same process in the retina in vivo. These effects were readily annulled either by sequestering PEDF or its derived neurotrophic peptides with the blocking P1 peptide, or by inhibiting the enzymatic activity of PEDF-R with the selective enzymatic inhibitor atglistatin. Every previously observed effect, exerted by PEDF or its neurotrophic peptides, was linked to their interaction with PEDF-R. The antiangiogenic domain-derived peptide showed no effects whatsoever. In a second line of research carried out in this thesis and described in the second chapter of this thesis, I delved on the potential PEDF production and secretion of induced pluripotent cell-derived retinal pigmented epithelium (RPE). Due to the fact that PEDF deficit has been correlated with an increased incidence of retinopathies, coupled with the observation that the pigmented epithelium itself is compromised in several of them; has led to the emergence of novel therapeutic strategies based on replacing the damaged retinal pigmented epithelium. One of the main approaches relies on generating RPE by the differentiation of induced pluripotent stem cells, obtained by the transduction of pluripotency factors in somatic cells by means of an episomal system. This approach must clear several hurdles before becoming viable, starting with confirming the identity and properties of this new RPE and how it compares to native RPE. The stem cell-derived human RPE was able to replicate the main hallmarks of native RPE, such as basalapical polarization, the capacity to phagocyte and metabolize PHR outer segments and to secrete PEDF. All these features were consistent even at 50 days post-induction, with PEDF secretion showing a significant increase over time. In conclusion, PEDF and its neurotrophic peptides exerted cytoprotective effects and stimulated neuronal development on photoreceptors and promoted neurite outgrowth amacrine neurons. All of these effects were driven by PEDF/PEDF-R interaction. Furthermore, stem cell-derived RPE showed a similar behavior to native RPE, allowing this approach of RPE replacement to be further considered as another potential therapeutic approach for the treatment of these diseases.

La cianotoxina β-N-metil-amino-L-alanina (BMAA) es un aminoácido no proteico producido por cianobacterias, capaz de biomagnificarse en las cadenas tróficas de ecosistemas marinos y terrestres. Dada su capacidad de atravesar la barrera hematoencefálica, su ingesta progresiva se asocia con el desarrollo de ciertas retinopatías, así como también de enfermedades neurodegenerativas, tales como la Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA), la Enfermedad de Parkinson (EP) y la Enfermedad de Alzheimer (EA). Los daños causados por la BMAA son múltiples y originados en mecanismos diversos. Así, la BMAA, en presencia de iones bicarbonato (HCO3 - ), puede formar un compuesto denominado carbamato, cuya estructura química es similar al glutamato (Glut), uno de los neurotransmisores más importantes del sistema nervioso. A su vez, el carbamato se une y activa receptores de Glut, ya sean ionotrópicos (como el receptor de N-metil-D- aspartato) o metabotrópicos. La sobreexcitación de estos receptores ocasionada por la BMAA, promueve mecanismos de excitotoxicidad que conducen a alteraciones neuronales. Por otro lado, la BMAA puede ingresar a las células a través del sistema xc, un sistema de transporte sodio-independiente común para cistina y Glut. Una vez en el interior celular, la toxina puede incorporarse erróneamente en las cadenas polipeptídicas en reemplazo de Serina (Ser). Así, unida a componentes proteicos, puede generar un reservorio endógeno de lenta liberación que expone a las neuronas a una baja pero continua dosis de esta toxina. Entre sus varios efectos subcelulares, la BMAA puede afectar la permeabilidad de las membranas mitocondriales comprometiendo su actividad. Además, puede inducir modificaciones en los niveles de Ca 2+, generar estrés oxidativo, promover fallas en la producción de ATP e inducir estrés en el retículo endoplasmático, lo cual conduce a alteraciones en la síntesis y/o distribución de proteínas. Asociado a esto, se originan alteraciones en el transporte axonal y la fragmentación de estas estructuras. Pese a su trascendencia para la salud, aún son desconocidos los efectos directos que genera la exposición a la BMAA de las neuronas y células gliales de la retina (como las células gliales de Müller –CGM-), o del epitelio pigmentario de la retina (EPR). Además, todavía son mayormente desconocidos aquellos factores o moléculas capaces de modular las vías de señalización involucradas en los efectos deletéreos inducidos por la BMAA. Al respecto, recientemente se ha propuesto que la activación de los receptores X retinoides (RXR) protegerían a las neuronas y modularían la respuesta inflamatoria durante las enfermedades neurodegenerativas del sistema nervioso central, y también en retinopatías. Aún se desconoce si estos receptores ejercen un rol protector contra los daños inducidos por la BMAA. En esta Tesis se estudiaron los mecanismos involucrados en los cambios degenerativos inducidos por la BMAA en células de la retina, así como también en células PC12 diferenciadas a neuronas. Asimismo, se evaluó el valor protector de agonistas de los RXRs frente a los efectos deletéreos inducidos por la BMAA en células de la retina. Para estos estudios, se obtuvieron cultivos puros de neuronas amacrinas y fotorreceptores (FRs), de CGM puros, y cultivos neuro-gliales a partir de retinas de ratas neonatas. Además, se utilizaron cultivos de líneas celulares PC12 y epiteliales ARPE- 19. Todos los cuales fueron tratados con la BMAA para evaluar sus efectos sobre estas células y el posible rol protector de los RXRs. Los resultados obtenidos en este trabajo demostraron que aún bajas concentraciones de la BMAA (de 0,4 μM) alteraron la viabilidad no sólo de las neuronas amacrinas y FRs, sino también de las células PC12 diferenciadas a neuronas, de las CGM e incluso de las células del EPR. La BMAA también, indujo alteraciones en la permeabilidad mitocondrial y en la producción de ROS en las células neuronales, gliales y epiteliales, mientras que en las CGM indujo cambios en la morfología nuclear. Por su parte, en neuronas amacrinas, promovió el crecimiento axonal, aunque generando el colapso de sus conos de crecimiento. Estas alteraciones fueron mediadas por la activación de los receptores NMDA en presencia de iones HCO3 - . Además, en estas células, la BMAA se incorporaría erróneamente en las cadenas polipeptídicas en reemplazo de la Ser, dado que la suplementación del medio de cultivo con este aminoácido previno la toxicidad inducida por la BMAA. En cuanto a la acción protectora de los RXRs, nuestros resultados demostraron que su activación bloqueó los efectos tóxicos que produjo la BMAA sobre las neuronas amacrinas y los FRs, así como también sobre las células del EPR. En resumen, en esta Tesis presentamos evidencias de que la BMAA afecta múltiples estructuras subcelulares en las células que conforman la retina, así como también a células PC12 diferenciadas. Estos resultados sugieren que los daños inducidos por la BMAA representan un potencial riesgo para la salud, y podrían contribuir al desarrollo de retinopatías, así como de varias enfermedades neurodegenerativas. Además, este trabajo indicaría que la activación de los RXRs puede presentar un papel protector al ejercer un rol relevante en la supervivencia de las neuronas amacrinas y FRs, así como también de las células del EPR. En su conjunto, estos hallazgos aportan nuevos conocimientos en relación a los mecanismos deletéreos inducidos por la BMAA y podrían ser de utilidad para el desarrollo de futuras estrategias terapéuticas. / The cyanotoxin β–N-methylamino-L-alanine (BMAA) is a non-proteinogenic amino acid produced by cyanobacteria. It is biomagnified along the food chains in both, marine and terrestrial ecosystems. Due to its ability to cross the brain blood barrier, its ingestion may contribute to the onset of retinopathies, as well as neurodegenerative diseases, like Amyotrophic Lateral Sclerosis, Parkinson (PD) and Alzheimer disease (AD). Damages induced by BMAA are multiple and originated by different mechanisms. In the presence of bicarbonate ions (HCO3 - ), BMAA can produce carbamate, whose chemical structure is similar to that of glutamate (Glut), one of the most important neurotransmitters in the nervous system. In turn, carbamate can bind and activate both ionotropic (like N-Methyl-D-aspartate -NMDA-) and metabotropic Glut receptors. Overactivation of these receptors by BMAA promotes excitotoxicity, which leads to nuclear alterations. On the other hand, BMAA crosses the cell membranes by using the cystine/glutamate antiporter (xc- system), a sodium-independent amino acid transporter. Once inside the cells, the toxin can mistakenly replace the amino acid Serine (Ser) in polypeptide chains, thus generating an endogenous reservoir of BMAA, whose slow- release exposes neurons to a low, but continuous amount of this toxin. Among its various subcellular effects, BMAA can alter mitochondrial membrane permeability compromising mitochondrial activity. Besides, it can alter Ca2+ levels, generate oxidative stress, promote failures in the ATP production and induce endoplasmic reticulum (RE) stress, leading to alterations in the protein synthesis and/or distribution. In this context, BMAA promotes alterations in axonal transport along with fragmentation of these structures. Despite its importance to health, the direct effects of BMAA exposure on retinal neurons and glial cells (such as Müller glial cells –CGM-), or retinal pigment epithelium (RPE) cells, are virtually unknown and the factors or molecules, which could modulate the signaling pathways involved in the deleterious effects induced by BMAA have not been established. In this regard, it has recently been proposed that the activation of Retinoid X Receptors (RXR) can protect neurons and modulate the inflammatory responses during neurodegenerative diseases of the central nervous system, including retinopathies. However, the possible protective roles of RXRs in BMAA-induced damages are still unknown. In this Thesis, we have studied the mechanisms involved in the degenerative changes induced by BMAA into retinal cells, and in neuron-like, differentiated rat pheochromocytoma cells (PC12 cells), as well. We also evaluated the protection of RXR agonists against the deleterious effects of BMAA in retinal cells. For these purposes, we obtained pure neuronal cultures of amacrine neurons and photoreceptors (PHRs); pure MGC cultures, and mixed neuro-glial cultures from newborn rats. In addition, we used PC12 cells and ARPE-19 epithelial cell lines. We treated them with BMAA to evaluate its effects on these cells and the possible protective roles of RXRs. Our results showed that low concentrations of BMAA (0.4 μM) altered, not only the viability of amacrine neurons and PHRs, but also that of neuronally differentiated PC12 cells, MGC and even that of the RPE cells. Also, the cyanotoxin induced alterations in mitochondrial membrane permeability and in ROS production, while in MGC, BMAA induced changes in the nuclear morphology. On the other hand, in amacrine neurons, this toxin promoted axonal growth, although simultaneously generating the collapse of their growth cones. We established that all these alterations were induced by activation of NMDA receptors in the presence of HCO3 - ions. Besides, in all these cell types, BMAA appeared to incorporate into polypeptide chains replacing Ser, since supplementation of the culture media with this amino acid prevented toxicity damages. Regarding the protective roles of RXRs, our results showed that their activation blocked the toxic effects induced by BMAA in amacrine neurons, PHRs, and RPE cells. In summary, in this Thesis we present evidences that BMAA affected multiple subcellular structures in retina cells and in PC12 cells differentiated into neurons. These results suggest that the damaging effects induced by BMAA represent a potential health risk, which could contribute to the development of retinopathies, along with other neurodegenerative diseases. In addition, this work would indicate that RXR activation can promote survival of amacrine PHRs and RPE cells. Taken together, these findings provide new knowledge regarding the deleterious mechanisms induced by BMAA, which could be useful for the development of future effective therapies.

En este trabajo de tesis nos concentramos en dos compo-nentes principales del sistema endógeno de defensa, impli-cados en el contexto de las enfermedades neurodegenerativas de la retina: la línea de defensa antioxidante, y las citoquinas de estrés. En el capitulo I, investigamos si los antioxidantes zeaxantina (ZEA), luteína (LUT), y β-caroteno (BC), los principales carotenoides de la dieta, protegen a los fotorre-ceptores del estrés oxidativo y si esa protección es sinérgica con la impartida por el ácido docosahexaenoico (DHA). Reali-zando cultivos neuronales puros de retinas de rata, encon-tramos que los pretratamientos con DHA, ZEA, LUT y BC redujeron la muerte de los fotorreceptores inducida por dos tipos de agentes oxidantes, paraquat (PQ) y peróxido de hi-drógeno (H2O2). Además de este efecto, ZEA y LUT incre-mentaron la diferenciación de los fotorreceptores, aumen-tando la expresión de opsina y promoviendo el desarrollo de procesos característicos de fotorreceptores maduros. Nues-tros resultados sugieren que las xantófilas ZEA y LUT junto al DHA podrían ser importantes factores ambientales que contri-buyen a la promoción de la supervivencia y diferenciación de los fotorreceptores. En el capitulo II, utilizamos los cultivos neuronales puros de retina de rata para estudiar el efecto protector directo de la neurocitoquina de estrés, el factor inhibidor de la leucemia (LIF), sobre fotorreceptores sujetos al estrés oxidativo inducido por PQ. Observamos que el pretrata-miento con LIF redujo la muerte celular y disminuyó la expresión de opsina en los cultivos, en una forma dependiente de la concentración. LIF activó la vía de señalización gp130/STAT3, lo que sugiere que este modelo es una poten-te herramienta para facilitar el estudio de los mecanismos que dirigen los efectos en la protección y en la diferenciación de LIF en los fotorreceptores de la retina. En el capítulo III investigamos mecanismos endógenos de neuroprotección de fotorreceptores in vivo en ratones usando un modelo de precondicionamiento con ciclos de luz/oscuridad (PC), seguido por exposición a daño agudo por luz (LD). Trabajos previos en el laboratorio del Dr. Ash demostraron que El PC induce la expresión de LIF y la activación de la vía gp130/STAT3. Aquí demostramos que el PC con luz moderada, previo al LD resultó en casi completa protección funcional y morfológica de los fotorreceptores. Estudiamos si el mecanismo de esta protección involucra la disminución en la acumulación de productos de oxidación. Hallamos que LD induce la oxidación de ADN en fotorreceptores. El PC previo redujo la oxidación de ADN como parte de la respuesta endógena de neuropro-tección inducida por este modelo. En el capítulo IV, investiga-mos si la activación de STAT3 inducida por LIF altera la actividad biológica de las células del epitelio pigmentado de la retina (RPE) in vivo. Generamos modelos de ratones knock-out para específicamente delecionar STAT3 o gp130 en el RPE, en la retina, o en ambos retina y RPE y realizamos inyecciones intravítreas de LIF en estos modelos. Establecimos que LIF regula negativamente la expresión y actividad de la isomerohidrolasa RPE65, componente clave del ciclo visual en el RPE, de manera coordinada con una reducción en la expresión de la rodopsina en los fotorreceptores, para disminuir la síntesis del fotopigmento visual. Dicha regulación se postula como neuroprotectora de la exposición al estrés por luz, o de enfermedades neurodegenerativas de la retina. Estos efectos en la retina y en el RPE fueron independientes y requirieron la activación de la vía de señalización gp130/STAT3 intrínseca de la retina y del RPE, respectivamente. / In this thesis, we focused on two main components of the endogenous defense system implicated in neurodegenerative diseases in the retina: the antioxidant line of defense and stress cytokines.In chapter I, we investigated whether the main carotenoids from the diet:zeaxantin (ZEA), lutein (LUT), and β-carotene (BC), protect photoreceptors from oxidative stress and whether this protection is synergis-tic with that given by docosahexaenoic acid (DHA). By per-forming pure neuronal cultures from rat retinas, we found that pretreatment with DHA, ZEA, LUT and BC reduced photo-receptor apoptotic cell death induced by two types of oxidants, paraquat (PQ) and hydrogen peroxide (H2O2).Also, ZEA and LUT increased the expression of opsin and promoted the development of processes that are characteristic of mature photoreceptors. Our results suggest that the xantho-phylls ZEA and LUT along with DHA could be important envi-ronmental cues contributing to the promotion of photore-ceptor survival and differentiation. In chapter II, we used pure neuronal cultures from rat retinas to study the direct effects of the stress neurocytokine, leukemia inhi-bitory factor (LIF), on photoreceptors exposed to oxidati-ve stress induced by PQ. We observed that pretreatment with LIF reduced photoreceptor cell death and decreased opsin expression in primary retinal neurons, in a dose-de-pendent manner. LIF activated the gp130/STAT3 signaling pathway, which suggests this model as a potent tool that could ease the study on mechanisms involved in the effects induced by LIF on photoreceptor survival and differentiation. In chapter III, we examined endogenous protective mechanisms of photoreceptor in 9 vivo, in mice exposed to a model of preconditioning with cycles of light/darkness (PC) followed by exposure to acute light damage (LD). Previous work in Dr. Ashs laboratory has demonstrated that the primary endogenous neuroprotective response in this model is the upregulation of LIF and increased gp130/STAT3 signaling in photoreceptors. Here, we demonstrated that PC with moderate levels of light prior to LD resulted in almost complete functional and morphological protection of photoreceptors. We studied whether the mechanism mediating this protection involved a reduction in the accumulations of oxidation products. We found that LD induced DNA oxidation in photoreceptors, but the prior treatment with PC decreased such oxidation as a part of the endogenous response induced by this model. In chapter IV, we aimed to investigate whether the activation of STAT3 induced by LIF alters the biological activities of the retinal pigmented epithelium (RPE) in vivo. We generated conditional knock-out mouse models with specific deletion of STAT3 or gp130 in the RPE, in the retina, or in both retina and RPE and we performed intravitreal injections of LIF in these animals. Our studies allowed us to establish that LIF downregulates the expression and activity of the isomerohydrolase RPE65, a key component in the visual cycle in the RPE, which is coordinated with a decrease in the expression of rhodopsin in photoreceptors, to diminish the synthesis of the visual photopigment. This coordinated downregulation is postulated to be neuroprotective in both light stress and in neurodegenerative diseases in the retina. The effects induced by LIF in the retina and the RPE were independent from each other and required the activation of the gp130/STAT3 signaling pathway intrinsic to retina and RPE, respectively.

Tesis por compendio / La retinosis pigmentaria (RP) es una forma de degeneración retiniana hereditaria caracterizada por la pérdida de los fotorreceptores (bastones y conos) de la retina. Constituye la principal causa genética de ceguera en los países desarrollados. Debido a su elevada heterogeneidad genética es difícil comprender los mecanismos patogenéticos responsables de la muerte de los fotorreceptores. Las mutaciones genéticas son las responsables de la apoptosis de los bastones. Sin embargo, la muerte de los conos parece debida a los cambios metabólicos que provoca la degeneración de los bastones como la hiperoxia (estrés oxidativo y nitrosativo), la secreción de diversos factores (citoquinas, quimioquinas) por parte de los bastones y otras células del entorno, etc. La muerte de los conos provoca la pérdida de la visión central en RP. El objetivo principal de este proyecto es evaluar el papel de la inflamación en pacientes con retinosis pigmentaria y en un modelo experimental, el ratón rd10. En concreto se determinará la presencia de factores inflamatorios en pacientes con RP y el efecto de la inhibición de la citoquina proinflamatoria, TNF¿, sobre la progresión de la enfermedad en el ratón rd10 y un modelo porcino ex vivo de degeneración retiniana. La caracterización y validación de este modelo ex vivo podría ser una alternativa útil para la comprensión de los mecanismos moleculares implicados en la muerte de los fotorreceptores en enfermedades retinianas. La inhibición del TNF¿ con anticuerpos específicos podría reducir el proceso inflamatorio y con ello, la muerte de los fotorreceptores en ratones rd10. Esto supondría el establecimiento de una nueva diana terapéutica para el desarrollo de tratamientos que previniesen o retrasasen el avance de la enfermedad en humanos. / Martínez Fernández De La Cámara, CI. (2015). Papel del estrés oxidativo y la inflamación en la retinosis pigmentaria. Efecto de la inhibición del TNFA en la progresión de la degeneración retiniana [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/48803 / Compendio