Diseña un sistema experto para reconocer el síndrome metabólico basado en redes neuronales, de tal manera que permita identificar los pacientes con síndrome metabólico (SM). Para ello revisa e identifica los criterios de diagnóstico de las organizaciones mundiales en la identificación del SM y el algoritmo back propagation para el entrenamiento de la red neuronal. / Tesis

La presente Tesis de Investigación Doctoral hace un análisis sistemático, sistémico y armónico del registro del potencial evocado hasta llegar a la codificación de esta señal bioeléctrica para su uso como registro individual específico mediante código de barras. El código nervioso de una señal sensorial, cuyos detalles falta descifrar, está conformado por un conjunto de señales eléctricas que procesan las redes neurales del sistema sensorial, los núcleos subcorticales y la corteza cerebral, el cual es posible analizar y decodificar. Las señales nerviosas sensoriales representan por sí solas el medio exterior, pero sus procesos esenciales son decodificados en la corteza cerebral, donde se activa la información psíquica correspondiente, el decodificar las señales neuronales y su significado. Estas señales se procesan en redes simétricas interconectadas en tiempo real, es decir, existen diferentes formas simétricas de señales en cualquier estructura del cerebro. Tomando al cerebro humano como sistema de emisión de señales bioelectromagnéticas, se crea una interfaz con el potencial evocado, lo que permite analizar las distintas latencias y amplitudes en forma de señales neuronales bioelectromágneticas, expresadas en minivoltios y hertzios, dentro de una longitud de onda que evoca el cerebro, utilizando modelos matemáticos como las series de Fourier, wavelets y fractales. En esta interfaz se introduce el código de barras que es un código basado en la representación mediante un conjunto de líneas paralelas verticales de distinto grosor y espaciado, que en su conjunto contienen una determinada información. De este modo, el código de barras permite reconocer rápidamente a una persona, en tanto permite generar un registro individual específico de esta persona. Con esta finalidad, se obtuvieron pruebas médicas del potencial evocado y se decodificaron mediante la trasformada de Fourier, lo que permitió la descomposición de la señal en componentes de frecuencias diferentes, g, que corresponde al espectro de frecuencias de la señal f. Luego, estas fueron procesadas mediante los modelos fractales, lográndose obtener una trasformada que se expresa en un código de barras personalizado. Es decir, el código nervioso es descifrado mediante la matematización con el uso de las series de Fourier y el procesamiento de la dimensión fractal y de su transformada, hacia un código de barras con múltiples aplicaciones en todas las ciencias. / -- The following Ph.D. thesis research presents a systematic, systemic and harmonic analysis from the evoked potential record until the encoding of this bioelectric signal; in order to use it as a specific individual record through barcode. The nervous code of a sensorial signal, which details need to be decoded, is formed by a group of electrical signal that processes the neural networks of the sensorial system, the sub cortical nuclei and the cerebral cortex. It is possible to analyze and decode. The sensorial nervous signals represent themselves the external mean, but their essential process is decoded at the cerebral cortex level, where it actives the respective psychic information. To decode the neural signals and their meaning. These signals are processed in real-time interconnected symmetrical networks, which mean there are different shapes of symmetrical signals within any brain structure. Taking the human brain as a bioelectromagnetic signal emission system, an interface is created with the evoked potential, which allows analyzing the different latencies and amplitudes through bioelectromagnetic neural signals, expressed on mini volts and hertz, within a wavelength that evokes the brain using mathematical models such as the Fourier series, wavelets and fractals. In this interface, a barcode is produced, which is a code based on the representation of a group of vertical parallel lines with different widths and spacings, storing specific information. In this manner, the barcode allows to recognize a person quickly, as it allows generating a specific individual record of this person. In this way, clinical tests of the evoked potential were obtained, they were decoded by the Fourier Transform, which allowed decomposing a signal into components of different frequency, g, represents the frequency spectrum of the signal f. Then, it was processed through fractal models obtaining a transform expressed by a personal barcode. In other words, the nervous code is decoded by mathematical means, using the Fourier series and the process fractal dimension and its transform, into a barcode with multiple applications to several sciences.

La presente Tesis de Investigación Doctoral hace un análisis sistemático, sistémico y armónico del registro del potencial evocado hasta llegar a la codificación de esta señal bioeléctrica para su uso como registro individual específico mediante código de barras. El código nervioso de una señal sensorial, cuyos detalles falta descifrar, está conformado por un conjunto de señales eléctricas que procesan las redes neurales del sistema sensorial, los núcleos subcorticales y la corteza cerebral, el cual es posible analizar y decodificar. Las señales nerviosas sensoriales representan por sí solas el medio exterior, pero sus procesos esenciales son decodificados en la corteza cerebral, donde se activa la información psíquica correspondiente, el decodificar las señales neuronales y su significado. Estas señales se procesan en redes simétricas interconectadas en tiempo real, es decir, existen diferentes formas simétricas de señales en cualquier estructura del cerebro. Tomando al cerebro humano como sistema de emisión de señales bioelectromagnéticas, se crea una interfaz con el potencial evocado, lo que permite analizar las distintas latencias y amplitudes en forma de señales neuronales bioelectromágneticas, expresadas en minivoltios y hertzios, dentro de una longitud de onda que evoca el cerebro, utilizando modelos matemáticos como las series de Fourier, wavelets y fractales. En esta interfaz se introduce el código de barras que es un código basado en la representación mediante un conjunto de líneas paralelas verticales de distinto grosor y espaciado, que en su conjunto contienen una determinada información. De este modo, el código de barras permite reconocer rápidamente a una persona, en tanto permite generar un registro individual específico de esta persona. Con esta finalidad, se obtuvieron pruebas médicas del potencial evocado y se decodificaron mediante la trasformada de Fourier, lo que permitió la descomposición de la señal en componentes de frecuencias diferentes, g, que corresponde al espectro de frecuencias de la señal f. Luego, estas fueron procesadas mediante los modelos fractales, lográndose obtener una trasformada que se expresa en un código de barras personalizado. Es decir, el código nervioso es descifrado mediante la matematización con el uso de las series de Fourier y el procesamiento de la dimensión fractal y de su transformada, hacia un código de barras con múltiples aplicaciones en todas las ciencias. / The following Ph.D. thesis research presents a systematic, systemic and harmonic analysis from the evoked potential record until the encoding of this bioelectric signal; in order to use it as a specific individual record through barcode. The nervous code of a sensorial signal, which details need to be decoded, is formed by a group of electrical signal that processes the neural networks of the sensorial system, the sub cortical nuclei and the cerebral cortex. It is possible to analyze and decode. The sensorial nervous signals represent themselves the external mean, but their essential process is decoded at the cerebral cortex level, where it actives the respective psychic information. To decode the neural signals and their meaning. These signals are processed in real-time interconnected symmetrical networks, which mean there are different shapes of symmetrical signals within any brain structure. Taking the human brain as a bioelectromagnetic signal emission system, an interface is created with the evoked potential, which allows analyzing the different latencies and amplitudes through bioelectromagnetic neural signals, expressed on mini volts and hertz, within a wavelength that evokes the brain using mathematical models such as the Fourier series, wavelets and fractals. In this interface, a barcode is produced, which is a code based on the representation of a group of vertical parallel lines with different widths and spacings, storing specific information. In this manner, the barcode allows to recognize a person quickly, as it allows generating a specific individual record of this person. In this way, clinical tests of the evoked potential were obtained, they were decoded by the Fourier Transform, which allowed decomposing a signal into components of different frequency, g, represents the frequency spectrum of the signal f. Then, it was processed through fractal models obtaining a transform expressed by a personal barcode. In other words, the nervous code is decoded by mathematical means, using the Fourier series and the process fractal dimension and its transform, into a barcode with multiple applications to several sciences.

Los fotorreceptores (FRs) son las neuronas que capturan la luz en el ojo, por lo que juegan un rol central en la visión. La pérdida progresiva de estas células durante ciertas enfermedades neurodegenerativas de la retina, como la retinitis pigmentosa o la degeneración macular, conduce a déficits de la visión y eventualmente a la ceguera. Estas patologías, así como otras que afectan al sistema nervioso central, están caracterizadas por la degeneración gradual, selectiva e irreversible de una población neuronal específica. La deficiencia de factores tróficos ha sido involucrada en muchos de estos procesos neurodegenerativos y es característica de la denominada muerte celular programada, tal como la que ocurre al momento de la sinaptogénesis en el desarrollo del sistema nervioso. En efecto, en la retina, así como también en otras partes del sistema nervioso, las neuronas requieren para su supervivencia, de factores tróficos, los cuales provienen de su entorno. El requerimiento de factores tróficos varía según el tipo celular y la etapa del desarrollo. En particular, para los FRs ya se han identificado varios de ellos, incluyendo el Factor Neurotrófico Derivado de la Glía (GDNF), el Factor Neutrófico Ciliar (CNTF), el Factor de Crecimiento Fibroblástico (FGF), el ácido docosahexaenoico (DHA), la esfingosina 1-fosfato (S1P) y, más recientemente, uno de los principales, el Factor Derivado del Epitelio Pigmentario (PEDF), una proteína con funciones neurotróficas y antiangiogénicas, asociadas a dominios separados de la proteína. La identificación de las secuencias de estos dominios ha permitido diseñar y sintetizar químicamente péptidos estables, como los fragmentos neurotróficos 44-mer y 17-mer, que conservan las propiedades de la proteína nativa y, por ende, de potencial valor médico. Sin embargo, estas características ventajosas requieren ser evaluadas en un modelo experimental adecuado. La mayoría del conocimiento actual sobre el PEDF se ha obtenido gracias a modelos in vivo, donde, debido su inherente complejidad, sumado a la cantidad de interacciones que ocurren entre las células y moléculas de tejidos circundantes, resulta difícil analizar los procesos involucrados. Una alternativa a este obstáculo son los cultivos primarios elegidos para realizar esta tesis, compuestos solo de neuronas amacrinas y FRs, las que, creciendo en medios químicamente definidos, permiten estudiarlas en un entorno mucho más controlado que en el organismo entero. En estos cultivos, los FRs se desarrollan independientemente, sin requerir la suplementación de factores tróficos, pero, una vez establecidas sus conexiones sinápticas, se tornan dependientes de los mismos para continuar con su desarrollo y prolongar supervivencia. La dependencia por estos factores hace de este sistema in vitro un modelo adecuado para evaluar el efecto de distintas moléculas sobre la supervivencia o diferenciación celular. Por ello, los resultados reseñados en el primer capítulo de esta tesis tuvieron como objetivo principal evaluar el efecto de PEDF y los péptidos derivados de su dominio neurotrófico y angiogénico en este modelo de cultivo primario de neuronas de retina. En estos cultivos, tanto los FRs como las neuronas amacrinas exhibieron el receptor de PEDF (PEDF-R), el cual es una fosfolipasa del tipo A2, localizado principalmente en la membrana celular. Por otro lado, la expresión del transcripto para PEDF-R mostró un patrón decreciente durante los primeros 5 días de cultivo, así como también en la retina in vivo, en el mismo periodo de desarrollo. Este patrón se observó también a nivel de la proteína, aunque su descenso en el tiempo fue más atenuado. Tanto el PEDF como los dos péptidos derivados de su dominio neurotrófico, protegieron a los FRs en cultivo de la muerte celular, caracterizada por ensayos de TUNEL y Anexina V. Además, previnieron la pérdida de la función mitocondrial evaluada mediante Mitotracker, y preservaron la integridad estructural de la membrana plasmática, analizada indirectamente por medio de ioduro de propidio y DAPI; dado que estos marcadores se visualizan una vez que se altera la permeabilidad de la membrana plasmática. Esta protección se debió principalmente a la interacción de PEDF con PEDF-R, y, en parte, al aumento constatado en la transcripción de factores antiapoptóticos como Bcl2 y Bcl2a1. El efecto del PEDF fue específico para la supervivencia de los FRs dado que el mismo no alteró la viabilidad de las neuronas amacrinas, la cual se mantuvo constante durante los días de cultivo analizados. Por el contrario, el PEDF y los péptidos 44-mer y 17-mer promovieron el desarrollo de neuritas en las neuronas amacrinas, e indujeron la diferenciación de los FRs, al promover la polarización de la rodopsina hacia el extremo apical de estas neuronas, tal como ocurre en los FRs maduros de la retina in vivo. Estos efectos fueron anulados eficientemente mediante el secuestro de PEDF o de sus péptidos por medio del péptido bloqueante P1, o por la inhibición de la actividad enzimática del PEDF-R mediante el inhibidor enzimático selectivo atglistatin. Todos los efectos del PEDF y sus péptidos neurotróficos fueron asociados a la interacción de los mismos con el PEDF-R. Por su parte, el fragmento derivado del dominio antiangiogénico del PEDF no tuvo ningún efecto. Por otro lado, también se indagó sobre el potencial del epitelio pigmentario de la retina (EPR) derivado de células madre pluripotentes (CMP) en la producción y liberación del PEDF. Dado que la deficiencia del PEDF ha sido correlacionada con una mayor incidencia de ciertas retinopatías y el hecho que el EPR puede estar comprometido en algunas de estas patologías, ha impulsado el desarrollo de estrategias orientadas a reemplazar el EPR dañado. Entre ellas se destaca la estrategia de generar EPR por medio de CMP obtenidas a partir de la inducción de células somáticas mediante la transducción de factores de pluripotencia por medio de un sistema episomal. Este tipo de estrategia requiere sortear múltiples obstáculos antes de ser viable, particularmente el de garantizar la identidad del nuevo EPR. El objetivo de esta línea de investigación, descripta en el segundo capítulo de esta tesis, fue evaluar los aspectos funcionales del EPR derivado de células madre, comparándolos con los del EPR nativo. El EPR derivado de CMP humanas recapituló las características distintivas del EPR nativo, como la polarización baso-apical, la capacidad de fagocitar y metabolizar segmentos externos de FRs y la producción de PEDF. Todas estas características se mantuvieron aun hasta 50 días después de su inducción, con la producción de PEDF incrementándose significativamente en función del tiempo. En conclusión, el PEDF y los péptidos derivados de su dominio neurotrófico ejercieron efectos citoprotectores y de diferenciación sobre los fotorreceptores y promovieron el crecimiento de neuritas en las neuronas amacrinas. Todos estos efectos fueron dependientes de la interacción entre PEDF y PEDF- R. Por otro lado, el EPR derivado de CMP examinado en este trabajo de tesis mostró un comportamiento similar al del EPR en la retina intacta, lo que permite considerar sus posibles capacidades terapéuticas para estas enfermedades / Photoreceptors (PHRs) are the retinal neurons, which react to light, making them a central component in the visual process. Their loss during certain retinal neurodegenerative diseases, such as retinitis pigmentosa or age-related macular degeneration, leads to a gradual decline of vision and ultimately to blindness. These pathologies, as well as others that target the central nervous system, are characterized by the gradual, selective and irreversible degeneration of specific neuronal cell types. The lack of trophic factors has been involved in many of these neurodegenerative processes and it is characteristic of the so- called programmed cell death, such as the one that occurs during the period of synaptogenesis within the developing nervous system. In the retina, just as any other portions of the nervous system, neurons are dependent on trophic factors, which are produced by their environment. Trophic factor requirements vary according to each cell type and its developmental stage. For the PHRs, many trophic factors have been already identified, including the Glial cell line-derived Neurotrophic Factor (GDNF), Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF), Fibroblastic Growth Factor (FGF), docosahexaenoic acid (DHA), sphingosine-1-phosphate (S1P) and, perhaps one of the most important among them, the Pigment Epitheliumderived Factor (PEDF). PEDF is a protein exhibiting both neurotrophic and antiangiogenic properties, which are conferred by two spatially-separated domains of the PEDF polypeptide. The identification of the sequences of these domains has allowed for the design and chemical synthesis of stable peptides, such as the neurotrophic fragments 44-mer and 17-mer, which could potentially retain the neurotrophic properties of the native protein, and therefore having a potential therapeutic value. However, these advantages should be first evaluated on an adequate experimental model. Up to now, most of our knowledge regarding PEDF has been obtained through in vivo models, which, due to their inherent complexity and the multiplicity of interactions between cells and their surrounding tissues, makes it difficult to analyze the specific processes occurring at a smaller scale. An alternative to overcome these limitations is the use of primary cultures chosen for the present thesis, composed solely of PHRs and amacrine neurons cultured in a chemically defined medium. These cultures allow the study of these neurons in a much more controlled environment when compared to a whole organism. PHRs in these cultures, initially develop and replicate without requiring trophic factor supplementation, but once they establish their synaptic connections, become reliant on them for their survival. This reliance makes this in vitro system an adequate testbed to evaluate the effects of different trophic factors on cell survival and differentiation. Therefore, the results of the first part of the thesis, which are shown in the first chapter, have the main objective of evaluating the effects of PEDF and peptides derived from its neurotrophic and antiangiogenic domains in a primary retinal cell culture-based model. In these cultures, both neuronal types exhibited the PEDF receptor (PEDF-R), which was primarily localized in the cell membrane. Additionally, the expression patterns for the PEDF-R transcript showed a decreasing trend on the first 5 days in culture, which was also observed in the in vivo environment. This pattern was also observed at the protein level, albeit in a less dramatic fashion. PEDF as well as its neurotrophic domain-derived peptides protected cultured PHRs from cell death, which was measured by TUNEL and Annexin V assays. Furthermore, they also prevented the loss of mitochondrial function, as evaluated by Mitotracker, and preserved the structural integrity of the plasma membrane analyzed by propidium iodide and DAPI staining, given that these markers are visualized once the plasma membrane permeability is altered. This protection was exerted through PEDF/PEDF-R interaction, along with the upregulation of antiapoptotic factors such as Bcl2 and Bcl2a1. This protective effect was PHR-specific, given that there was no significant difference in the survival rate of amacrine neurons, which was constant throughout the observed timeframe. Furthermore, PEDF and the 44-mer and 17-mer peptides promoted neurite outgrowth in amacrine neurons and induced PHR differentiation by promoting apical rhodopsin polarization, mimicking the same process in the retina in vivo. These effects were readily annulled either by sequestering PEDF or its derived neurotrophic peptides with the blocking P1 peptide, or by inhibiting the enzymatic activity of PEDF-R with the selective enzymatic inhibitor atglistatin. Every previously observed effect, exerted by PEDF or its neurotrophic peptides, was linked to their interaction with PEDF-R. The antiangiogenic domain-derived peptide showed no effects whatsoever. In a second line of research carried out in this thesis and described in the second chapter of this thesis, I delved on the potential PEDF production and secretion of induced pluripotent cell-derived retinal pigmented epithelium (RPE). Due to the fact that PEDF deficit has been correlated with an increased incidence of retinopathies, coupled with the observation that the pigmented epithelium itself is compromised in several of them; has led to the emergence of novel therapeutic strategies based on replacing the damaged retinal pigmented epithelium. One of the main approaches relies on generating RPE by the differentiation of induced pluripotent stem cells, obtained by the transduction of pluripotency factors in somatic cells by means of an episomal system. This approach must clear several hurdles before becoming viable, starting with confirming the identity and properties of this new RPE and how it compares to native RPE. The stem cell-derived human RPE was able to replicate the main hallmarks of native RPE, such as basalapical polarization, the capacity to phagocyte and metabolize PHR outer segments and to secrete PEDF. All these features were consistent even at 50 days post-induction, with PEDF secretion showing a significant increase over time. In conclusion, PEDF and its neurotrophic peptides exerted cytoprotective effects and stimulated neuronal development on photoreceptors and promoted neurite outgrowth amacrine neurons. All of these effects were driven by PEDF/PEDF-R interaction. Furthermore, stem cell-derived RPE showed a similar behavior to native RPE, allowing this approach of RPE replacement to be further considered as another potential therapeutic approach for the treatment of these diseases.

Through an attractive hypothesis of work, we present the relaTionship between the frontal lobes and the neurobiological bases of Freud's psychoanalytic theory. We review and discuss the psycophysiological and clinical aproachs, in order to understand this relationship, arriving to the final examination of the organic and functional "disolutions" of the brain. We study and discuss the clinical progressive symptoms of the dementia and the differencial diagnosis of abnormal behavior, inrerpreted under the bases of Freud's theory. In this way it would be possible to arrive through some tempting interpretation of the psychopatic behavior, drug addiction and the last "syndrome of terrorism". / Se trata de establecer mediante una atractiva hipótesis de trabajo, las relaciones entre los lóbulo frontales y las bases neurobiológicas de la teoría freudiana del psicoanálisis. Se presenran y discuten las aproximaciones psicofisiológicas y clínicas, en la interpretación de estas relaciones, llegando al análisis final de las "disoluciones" orgánicas y funcionales del cerebro, pasando revista a los síntomas de la demencia y cuadros clínicos diferenciales, por los cuales se puede llegar a la interpretación freudiana de la psicopatía, la farmacodependencia y el síndrome del terrorismo.

Programa de Doctorado: Biotecnología en ciencias de la salud (Biotecnología y Bíomedicina)

La presencia de glucógeno en las neuronas ha sido motivo de controversia durante las pasadas décadas. Sin embargo, está aceptado que las neuronas expresan la maquinaria necesaria para sintetizar glucógeno, pero no para degradarlo. La presencia de la glucógeno sintasa (GS) en las neuronas es un misterio y no existe ningún estudio que analice cuál es su función fisiológica en este tipo neuronal. Recientemente se ha establecido un paralelismo entre la GS neuronal y el caballo de Troya, ya que múltiples estudios han demostrado que una hiper-activación de la GS y la consecuente acumulación de glucógeno desencadenan la entrada en apoptosis. A pesar de ello, la neurona gasta energía para su transcripción y traducción, lo que hace pensar que su presencia en la neurona es importante para su correcto funcionamiento. Los objetivos de esta tesis doctoral son los siguientes: 1. Caracterización del metabolismo de glucógeno y de su presencia en neuronas. 2. Estudio de la maquinaria de degradación de glucógeno en neuronas y su regulación en hipoxia 3. Análisis de la síntesis de glucógeno en neuronas expuestas a hipoxia. 4. Evaluación de la función biológica de la GS en neuronas bajo condiciones de hipoxia. Los resultados de esta tesis revelan que las neuronas tienen una síntesis de glucógeno activa, y, además, lo acumulan en condiciones basales. Además, poseen la maquinaria necesaria para la degradación de glucógeno y degradan sus propias reservas en condiciones de hipoxia. La capacidad neuronal de degradación de glucógeno está presente en una situación in vivo, ya que las neuronas del modelo Drosophila melanogaster movilizan sus reservas en condiciones de hipoxia, y las neuronas de Purkinje en el ratón lo hacen tras una anoxia post-mortem prolongada. La maquinaria de degradación del polisacárido, desconocida hasta el momento, está mediada por la expresión de la glucógeno fosforilasa (GP). Las neuronas expresan la isoforma cerebral del enzima, pero no la muscular, como en el caso de los astrocitos. Esta isoforma está presente tanto en neuronas en cultivo como en neuronas procedentes de cortes de cerebro de ratón adulto. La hipoxia causa la defosforilación y activación de la GS. La GS sintetiza glucógeno activamente, aunque los niveles netos del polisacárido disminuyen en hipoxia. Por tanto, está teniendo lugar un ciclo aparentemente fútil en donde la síntesis y degradación se encuentran activas. Finalmente se ha demostrado que el metabolismo del glucógeno forma parte de la maquinaria de protección que activa la neurona para resistir a la hipoxia. En consecuencia, las neuronas que carecen la GS tienen una mortalidad más elevada que aquellas que sí que expresan el enzima. En el modelo de la mosca, el metabolismo del glucógeno neuronal también juega un papel en la tolerancia a la hipoxia y moscas con niveles reducidos de GS específicamente en la neurona muestran un empeoramiento en la respuesta tras un período de bajo oxígeno. En conclusión, esta tesis presenta evidencias de que las neuronas poseen un metabolismo activo de glucógeno que, además, juega un papel clave en la tolerancia de estas células a condiciones de hipoxia. / The presence of glycogen in neurons has been a matter of debate for the past decades. However, it is accepted that neurons express the necessary machinery to synthesize glycogen, but not for degrading it. The presence of Glycogen Synthase (GS) in neurons is a mystery and there is no study which approaches its physiological function in this cellular type. Recently a parallelism has been drawn between GS and the Trojan horse, since several studies have shown that an over-activation of GS and an accumulation of glycogen cause apoptosis in the neurons. Nevertheless, neurons waste energy for transcribing and synthesizing the protein, which suggests that its presence might be important for the normal functioning of the neurons. The aims of the thesis are the follows 1) Characterization of glycogen metabolism and its presence in neurons 2) Study of the glycogen degradation machinery in neurons and its regulation in hypoxia 3) Analysis of the synthesis of glycogen in neurons exposed to hypoxia 4) Evaluation of the biological function of GS in neurons under hypoxia conditions The results of this thesis reveal that there is an active glycogen synthesis under normal conditions. In addition, they express the necessary machinery to degrade the polysaccharide and degrade it under hypoxia conditions. The neuronal capacity of glycogen degradation is present in the in vivo situation, both in neurons from Drosophila melanogaster and from mice. The glycogen degradation machinery is mediated through the expression of glycogen phosphorylase (GP). Neurons express the brain isoform of the enzyme, but not the muscle, as astrocytes do. This isoform is present in neuronal cultures, as well as in neurons from adult mice brain slices. Hypoxia causes the dephosphorylation and activation of GS. GS actively synthesizes glycogen, although the global glycogen levels diminished in hypoxia. Indeed, an apparent futile cycle is taking place under hypoxia, where both synthesis and degradation are activated. Finally, we have demonstrated that glycogen metabolism is part of the protection machinery the neuron activates for tolerating the hypoxia conditions. Consequently, neurons without GS have a higher mortality rate that these who actively express the enzyme. In Drosophila melanogaster, flies with reduced GS levels specifically in neurons have an impaired phenotype in their reponse to hypoxic conditions. In conclusion, this thesis presents evidences that show neurons have an active glycogen metabolism which plays a key role in the neuronal response to hypoxia.

La diferenciació dels precursors neuronals en cèl·lules especialitzades implica una restricció de la seva capacitat proliferativa i la sortida definitiva del cicle cel·lular. Entre les proteïnes HLH activadores de la diferenciació hi ha les proteïnes E (E47, E12, HEB, E2-2), les quals s’expressen a la majoria de teixits. Al nostre laboratori es va descriure que la proteïna E47 forma heterodímers amb la proteïna HLH específica de teixit NeuroD, i activa l’expressió del receptor del BDNF (TrkB) i l’inhibidor de cicle p21CIP en resposta a la senyal diferenciadora d’àcid retinoic (RA). La correcta expressió del receptor TrkB juga un paper clau en el desenvolupament del sistema nerviós en vertebrats i la seva alteració s’ha relacionat amb diferents malalties humanes importants. En aquest treball s’ha demostrat que la quinasa MLK2 interacciona amb la bHLH E47 en cèl·lules de neuroblastoma SHSY-5Y. Es proposa que la MLK2 controla l’activitat del factor bHLH E47 a través de la seva fosforilació, la qual redueix l’activació del promotor de trkB. A més, la inhibició de la MLK2 augmenta l’expressió de l’mRNA de trkB in vivo explicant perquè aquesta inhibició no només prevé l’activació dels processos de mort cel·lular sinó que també ajuda a les vies de supervivència. D’altra banda, estudis molt recents revelen la importància dels processos de localització d’mRNAs als axons i a les dendrites i la seva traducció localitzada. Conèixer com es regula la localització dels mRNAs i la seva traducció localitzada a nivell molecular ajuda a entendre aspectes fonamentals de la plasticitat i la diferenciació neuronal. Durant el transport dels mRNAs, la seva traducció està reprimida i aquesta s’activa a llocs concrets com a resposta a senyals sinàptics, i en conseqüència, s’activa la plasticitat neuronal. Prèviament, al nostre laboratori, es va demostrar que la proteïna KIS pot estimular la traducció localitzada d’mRNAs, afavorir el creixement neurític i la supervivència neuronal. En aquest treball demostrem que la KIS interacciona amb proteïnes i mRNAs implicats en activitat sinàptica, els quals són transportats a través de partícules mRNP. La nostra hipòtesi és que quan el grànul transportat per KIF3A arriba al seu destí, diversos estímuls sinàptics possiblement indueixin l’activació de la quinasa Src, la qual fosforila la KIS, activant la traducció dels mRNAs transportats. / La diferenciación de precursores neuronales en células especializadas implica la restricción de su capacidad proliferativa y la salida definitiva del ciclo celular. Entre las proteínas HLH activadoras de la diferenciación están las proteínas E (E47, E12, HEB, E2-2) las cuales se expresan en la mayoría de los tejidos. En nuestro laboratorio se describió que la proteína E47 forma heterodímeros con la proteína HLH especifica de tejido, NeuroD, y activa la expresión del receptor de BDNF (TrkB) y el inhibidor de ciclo p21CIP en respuesta a la señal diferenciadora del ácido retinoico (RA). La correcta expresión del receptor TrkB juega un papel clave en el desarrollo del sistema nervioso en vertebrados y su alteración se ha relacionado con diferentes enfermedades humanas importantes. En este trabajo se ha demostrado que la quinasa MLK2 interacciona con la bHLH E47 en células de neuroblastoma SHSY-5Y. Se propone que MLK2 controla la actividad del factor bHLH E47 a través de su fosforilación, la cual reduce la activación del promotor de trkB. Además la inhibición de MLK2 aumenta la expresión del mRNA de trkB in vivo explicando por qué esta inhibición no sólo previene la activación de los procesos de muerte celular sino que también ayuda a las vías de supervivencia. Por otro lado, estudios muy recientes revelan la importancia de los procesos de localización de mRNAs en axones y dendritas y de su traducción localizada. Conocer cómo se regula la localización de los mRNAs y su traducción localizada a nivel molecular ayuda a entender aspectos fundamentales de la plasticidad y la diferenciación neuronal. Durante el transporte de los mRNAs su traducción está reprimida y ésta se activa en lugares concretos en respuesta a señales sinápticas resultando en la activación de la plasticidad neuronal. Previamente, en nuestro laboratorio, se demostró que la proteína KIS puede estimular la traducción localizada de mRNAs, favorecer el crecimiento neurítico y la supervivencia neuronal. En este trabajo demostramos que KIS interacciona con proteínas y mRNAs implicados en actividad sináptica, los cuales son transportados a través de partículas mRNPs. Nuestra hipótesis es que cuando el gránulo transportado por KIF3A llega a su destino, varios estímulos sinápticos posiblemente induzcan la activación de la quinasa Src la cual fosforila KIS, activando la traducción de los mRNAs transportados. / The differentiation of neuronal precursors in specialized cells induces an increase of a restriction of their proliferative capacity and a complete exit of the cell cycle. Among the HLH protein activators of differentiation the E protein family (E47, E12, HEB, E2-2) is expressed in most of the tissues. In our laboratory it has been described that in response to the differentiating signal of retinoic acid (RA), E47 heterodimerizes with the HLH protein tissue specific NeuroD which activates the expression of the receptor BDNF (TrkB) and the cell cycle p21CIP inhibitor. TrkB expression plays a key role in the nervous system development in vertebrates, and its alteration has been related with different types of important human diseases. In the present work we identified the kinase MLK2 as an E47-interaction protein in SHSY-5Y human neuroblastoma cells. We propose MLK2 as a controller of the BDNF receptor TrkB through the phosphorylation of bHLH transcription factor E47 which reduces the activation of trkB promoter. Furthermore, MLK2 inhibition increases trkB mRNA expression in vivo. These results could explain the reason why the inhibition of MLKs avoid the activation of cell death program and also increase the cell survival pathway being a key component of their neuroprotector potential. In the other hand, recent studies some recent work reveal the importance of mRNA localization in axons and dendrites and its local translation. Unraveling how mRNA localization and its translation are regulated at molecular level will help to understand basic processes of neuronal differentiation and plasticity. Translation is inhibited during mRNA transport, and is activated in specific synapses in response to synapse signals resulting from activation of neuronal plasticity. Previous work from our laboratory demonstrated that protein kinase KIS can stimulate the local translation of mRNAs, increase the neuritic outgrowth and the neural survival. In the present work we demonstrate that KIS can interact with transported granular proteins and mRNAs importants for the synaptic activity. Our hypothesis is that when the granule reaches his fate through KIF3A, some synaptic stimuli induce the activation of the kinase Src, which phosphorylates KIS, therefore activating the transported transcript.

[ES] Los cilios son estructuras eucariotas complejas conservadas evolutivamente que, proyectando desde la superficie de las células, desempeñan un gran número de funciones biológicas. Los cilios se clasifican tradicionalmente en móviles o sensoriales y en su composición intervienen cientos de proteínas. Este conjunto de genes que codifican para los componentes ciliares se conoce como cilioma. Las mutaciones en el cilioma subyacen a un grupo cada vez mayor de enfermedades multisistémicas altamente pleiotrópicas denominadas globalmente como ciliopatías. Estas enfermedades se caracterizan, entre otros síntomas, por retraso mental, defectos sensoriales y/o trastornos metabólicos. A pesar de que se estima que 1 de cada 1.000 personas está afectada por estas enfermedades, las bases moleculares de las ciliopatías son todavía poco conocidas. El adecuado ensamblaje y funcionalidad del cilio requieren de la expresión estrechamente coordinada de los componentes del cilio; sin embargo, se sabe poco sobre la lógica reguladora que controla la transcripción del cilioma. La mayoría de los genes del cilioma son compartidos tanto por cilios móviles como sensoriales. Los factores de transcripción (FTs) de la familia RFX tienen un papel evolutivamente conservado en la regulación transcripcional del cilioma tanto móvil como sensorial. En los vertebrados, la transcripción del cilioma móvil también está regulada directamente por FoxJ1, un FT de la familia forkhead (FKH). Sin embargo, hasta la fecha, se desconocen los FTs que actúan junto a RFX en la transcripción del cilioma sensorial en cualquier organismo. En este trabajo, hemos identificado a FKH-8, un FT de la familia FKH, como selector terminal del cilioma sensorial de C. elegans. fkh-8 se expresa de forma consistente en las sesenta neuronas sensoriales ciliadas de C. elegans, se une a las regiones reguladoras de los genes del cilioma sensorial, también es necesario para la correcta expresión de los genes del cilioma y actúa de forma sinérgica con el conocido regulador maestro de la ciliogénesis DAF19/RFX. En consecuencia, los mutantes para fkh-8 muestran una amplia gama de defectos de comportamiento en una plétora de paradigmas sensoriales, incluyendo la olfacción, la gustación y la mecano-sensación. Así, hemos identificado, por primera vez, un FT que actúa junto con los FTs de la familia RFX en la regulación directa del cilioma sensorial. Además, nuestros resultados, junto con trabajos anteriores, muestran que los FTs FKH y RFX actúan conjuntamente en la regulación de los cilios tanto móviles como sensoriales, lo que sugiere que esta lógica reguladora podría ser un rasgo evolutivo antiguo anterior a la subespecialización funcional de los cilios. Finalmente, esperamos que los resultados de nuestro trabajo ayuden a entender mejor las bases biológicas de las ciliopatías huérfanas / [CA] Els cilis són estructures eucariotes complexes conservades evolutivament que, projectant des de la superfície de les cèl·lules, exerceixen un gran nombre de funcions biològiques. Els cilis es classifiquen tradicionalment en mòbils o sensorials i en la seua composició intervenen centenars de proteïnes. Aquest conjunt de gens que codifiquen per als components ciliars es coneix com el cilioma. Les mutacions en el cilioma subjauen a un grup cada vegada major de malalties multisistèmiques altament pleiotròpiques denominades globalment com ciliopaties. Aquestes malalties es caracteritzen, entre altres símptomes, per retard mental, defectes sensorials i/o trastorns metabòlics. A pesar que s'estima que 1 de cada 1.000 persones està afectada per aquestes malalties, les bases moleculars de les ciliopaties són encara poc conegudes. L'adequat assemblatge i funcionalitat del cili requereixen de l'expressió estretament coordinada dels components del cili; no obstant això, se sap poc sobre la lògica reguladora que controla la transcripció del cilioma. La majoria dels gens del cilioma són compartits tant per cilis mòbils com sensorials. Els factors de transcripció (FTs) de la família RFX tenen un paper evolutivament conservat en la regulació transcripcional del cilioma tant mòbil com sensorial. En els vertebrats, la transcripció del cilioma mòbil també està regulada directament per FoxJ1, un FT de la família forkhead (FKH). No obstant això, fins hui, es desconeixen els FTs que actuen al costat de RFX en la transcripció del cilioma sensorial en qualsevol organisme. En aquest treball, hem identificat a FKH-8, un FT de la família FKH, com a selector terminal del cilioma sensorial de C. elegans. fkh-8 s'expressa de manera consistent en les seixanta neurones sensorials ciliades de C. elegans, s'uneix a les regions reguladores dels gens del cilioma sensorial, també és necessari per a la correcta expressió dels gens del cilioma i actua de manera sinèrgica amb el conegut regulador mestre de la ciliogènesi DAF-19/RFX. En conseqüència, els mutants per a fkh-8 mostren una àmplia gamma de defectes de comportament en una plètora de paradigmes sensorials, incloent la olfacció, la gustació i la mecano-sensació. Així, hem identificat, per primera vegada, un FT que actua juntament amb els FTs de la família RFX en la regulació directa del cilioma sensorial. A més, els nostres resultats, juntament amb treballs anteriors, mostren que els FTs FKH i RFX actuen conjuntament en la regulació dels cilis tant mòbils com sensorials, la qual cosa suggereix que aquesta lògica reguladora podria ser un tret evolutiu antic anterior a la subespecialització funcional dels cilis. Finalment, esperem que els resultats del nostre treball ajuden a entendre millor les bases biològiques de les ciliopaties òrfenes. / [EN] Cilia are complex evolutionary conserved eukaryotic structures that, projecting from cell surfaces, perform a variety of biological roles. Cilia are traditionally classified into motile or sensory and hundreds of proteins take part in their composition. This set of genes coding for ciliary components is known as the ciliome. Mutations in the ciliome underlie an ever-growing group of highly pleiotropic multisystemic diseases globally termed as ciliopathies. These diseases are characterized, among other symptoms, by mental retardation, sensory defects and/or metabolic disorders. Despite an estimated 1 in 1,000 people affected by these diseases, the molecular bases of the ciliopathies are still poorly understood. Proper cilium assembly and functionality requires the tightly co-regulated expression of ciliary components; however, little is known about the regulatory logic controlling ciliome transcription. Most ciliome genes are shared between motile and sensory cilia. RFX transcription factors (TFs) have an evolutionarily conserved role in the transcriptional regulation of both motile and sensory ciliome. In vertebrates, transcription of motile ciliome is also directly regulated by FoxJ1, a Forkhead (FKH) TF. However, to date, TFs working together with RFX in the transcription of the sensory ciliome are unknown in any organism. In this work, we have identified FKH-8, a FKH TF, as a terminal selector of the sensory ciliome in C. elegans. fkh-8 is consistently expressed within the sixty ciliated sensory neurons of C. elegans, it binds the regulatory regions of the sensory ciliome genes, it is also required for correct ciliome gene expression and acts synergistically with the known master regulator of the ciliogenesis DAF-19/RFX. Accordingly, fkh-8 mutants display a wide range of behavioural defects in a plethora of sensory mediated paradigms, including olfaction, gustation, and mechano-sensation. Thus, we have identified, for the first time, a TF that acts together with RFX TFs in the direct regulation of the sensory ciliome. Moreover, our results, together with previous work, show that FKH and RFX TFs act together in the regulation of both motile and sensory cilia, suggesting this regulatory logic could be an ancient trait pre-dating functional sub-specialization of cilia. Finally, we hope our results could help better understand the biological basis of orphan ciliopathies. / This thesis project has been made possible thanks to a pre-doctoral fellowship from the FPI Programme (BES-2015-072799) conferred by the (now extinct) Spanish Ministry of Economy & Competitivity. The following grants also provided a funding frame throughout the whole research process: “Estudio de los mecanismos transcripcionales que regulan la diferenciación de las neuronas monoaminérgicas y su conservación evolutiva.” SAF2014-56877-R “Dissecting the gene regulatory mechanisms that generate serotonergic neurons and their link to mental disorders.” ERC-St 281920 “Programas de regulación transcripcional asociados a enfermedades genéticas.” SAF2017-84790-R “Regulatory rules and evolution of neuronal gene expression.” ERC-Co 101002203 / Brocal Ruiz, R. (2022). Transcriptional Regulatory Logic of Cilium Formation in C. Elegans [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/181667 / TESIS