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Efectos degenerativos inducidos por la cianotoxina β-N-metilamino-L-alanina (BMAA) en células de retinaSoto, Tamara B. 07 July 2023 (has links)
La cianotoxina β-N-metil-amino-L-alanina (BMAA) es un aminoácido no proteico
producido por cianobacterias, capaz de biomagnificarse en las cadenas tróficas de
ecosistemas marinos y terrestres. Dada su capacidad de atravesar la barrera
hematoencefálica, su ingesta progresiva se asocia con el desarrollo de ciertas
retinopatías, así como también de enfermedades neurodegenerativas, tales como la
Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA), la Enfermedad de Parkinson (EP) y la Enfermedad
de Alzheimer (EA).
Los daños causados por la BMAA son múltiples y originados en mecanismos diversos.
Así, la BMAA, en presencia de iones bicarbonato (HCO3
-
), puede formar un compuesto
denominado carbamato, cuya estructura química es similar al glutamato (Glut), uno de
los neurotransmisores más importantes del sistema nervioso. A su vez, el carbamato se
une y activa receptores de Glut, ya sean ionotrópicos (como el receptor de N-metil-D-
aspartato) o metabotrópicos. La sobreexcitación de estos receptores ocasionada por la
BMAA, promueve mecanismos de excitotoxicidad que conducen a alteraciones
neuronales. Por otro lado, la BMAA puede ingresar a las células a través del sistema xc,
un sistema de transporte sodio-independiente común para cistina y Glut. Una vez en el
interior celular, la toxina puede incorporarse erróneamente en las cadenas
polipeptídicas en reemplazo de Serina (Ser). Así, unida a componentes proteicos, puede
generar un reservorio endógeno de lenta liberación que expone a las neuronas a una
baja pero continua dosis de esta toxina.
Entre sus varios efectos subcelulares, la BMAA puede afectar la permeabilidad de las
membranas mitocondriales comprometiendo su actividad. Además, puede inducir
modificaciones en los niveles de Ca
2+, generar estrés oxidativo, promover fallas en la
producción de ATP e inducir estrés en el retículo endoplasmático, lo cual conduce a
alteraciones en la síntesis y/o distribución de proteínas. Asociado a esto, se originan
alteraciones en el transporte axonal y la fragmentación de estas estructuras.
Pese a su trascendencia para la salud, aún son desconocidos los efectos directos que
genera la exposición a la BMAA de las neuronas y células gliales de la retina (como las
células gliales de Müller –CGM-), o del epitelio pigmentario de la retina (EPR). Además,
todavía son mayormente desconocidos aquellos factores o moléculas capaces de
modular las vías de señalización involucradas en los efectos deletéreos inducidos por la
BMAA. Al respecto, recientemente se ha propuesto que la activación de los receptores
X retinoides (RXR) protegerían a las neuronas y modularían la respuesta inflamatoria
durante las enfermedades neurodegenerativas del sistema nervioso central, y también
en retinopatías. Aún se desconoce si estos receptores ejercen un rol protector contra
los daños inducidos por la BMAA. En esta Tesis se estudiaron los mecanismos
involucrados en los cambios degenerativos inducidos por la BMAA en células de la
retina, así como también en células PC12 diferenciadas a neuronas. Asimismo, se
evaluó el valor protector de agonistas de los RXRs frente a los efectos deletéreos
inducidos por la BMAA en células de la retina.
Para estos estudios, se obtuvieron cultivos puros de neuronas amacrinas y
fotorreceptores (FRs), de CGM puros, y cultivos neuro-gliales a partir de retinas de ratas
neonatas. Además, se utilizaron cultivos de líneas celulares PC12 y epiteliales ARPE-
19. Todos los cuales fueron tratados con la BMAA para evaluar sus efectos sobre estas
células y el posible rol protector de los RXRs.
Los resultados obtenidos en este trabajo demostraron que aún bajas concentraciones
de la BMAA (de 0,4 μM) alteraron la viabilidad no sólo de las neuronas amacrinas y FRs,
sino también de las células PC12 diferenciadas a neuronas, de las CGM e incluso de
las células del EPR.
La BMAA también, indujo alteraciones en la permeabilidad mitocondrial y en la
producción de ROS en las células neuronales, gliales y epiteliales, mientras que en las
CGM indujo cambios en la morfología nuclear. Por su parte, en neuronas amacrinas,
promovió el crecimiento axonal, aunque generando el colapso de sus conos de
crecimiento.
Estas alteraciones fueron mediadas por la activación de los receptores NMDA en
presencia de iones HCO3
-
. Además, en estas células, la BMAA se incorporaría
erróneamente en las cadenas polipeptídicas en reemplazo de la Ser, dado que la
suplementación del medio de cultivo con este aminoácido previno la toxicidad inducida
por la BMAA.
En cuanto a la acción protectora de los RXRs, nuestros resultados demostraron que su
activación bloqueó los efectos tóxicos que produjo la BMAA sobre las neuronas
amacrinas y los FRs, así como también sobre las células del EPR.
En resumen, en esta Tesis presentamos evidencias de que la BMAA afecta múltiples
estructuras subcelulares en las células que conforman la retina, así como también a
células PC12 diferenciadas.
Estos resultados sugieren que los daños inducidos por la BMAA representan un
potencial riesgo para la salud, y podrían contribuir al desarrollo de retinopatías, así como
de varias enfermedades neurodegenerativas. Además, este trabajo indicaría que la
activación de los RXRs puede presentar un papel protector al ejercer un rol relevante en
la supervivencia de las neuronas amacrinas y FRs, así como también de las células del
EPR.
En su conjunto, estos hallazgos aportan nuevos conocimientos en relación a los
mecanismos deletéreos inducidos por la BMAA y podrían ser de utilidad para el
desarrollo de futuras estrategias terapéuticas. / The cyanotoxin β–N-methylamino-L-alanine (BMAA) is a non-proteinogenic amino acid
produced by cyanobacteria. It is biomagnified along the food chains in both, marine and
terrestrial ecosystems. Due to its ability to cross the brain blood barrier, its ingestion may
contribute to the onset of retinopathies, as well as neurodegenerative diseases, like
Amyotrophic Lateral Sclerosis, Parkinson (PD) and Alzheimer disease (AD).
Damages induced by BMAA are multiple and originated by different mechanisms. In the
presence of bicarbonate ions (HCO3
-
), BMAA can produce carbamate, whose chemical
structure is similar to that of glutamate (Glut), one of the most important
neurotransmitters in the nervous system. In turn, carbamate can bind and activate both
ionotropic (like N-Methyl-D-aspartate -NMDA-) and metabotropic Glut receptors.
Overactivation of these receptors by BMAA promotes excitotoxicity, which leads to
nuclear alterations. On the other hand, BMAA crosses the cell membranes by using the
cystine/glutamate antiporter (xc- system), a sodium-independent amino acid transporter.
Once inside the cells, the toxin can mistakenly replace the amino acid Serine (Ser) in
polypeptide chains, thus generating an endogenous reservoir of BMAA, whose slow-
release exposes neurons to a low, but continuous amount of this toxin.
Among its various subcellular effects, BMAA can alter mitochondrial membrane
permeability compromising mitochondrial activity. Besides, it can alter Ca2+ levels,
generate oxidative stress, promote failures in the ATP production and induce
endoplasmic reticulum (RE) stress, leading to alterations in the protein synthesis and/or
distribution. In this context, BMAA promotes alterations in axonal transport along with
fragmentation of these structures.
Despite its importance to health, the direct effects of BMAA exposure on retinal neurons
and glial cells (such as Müller glial cells –CGM-), or retinal pigment epithelium (RPE)
cells, are virtually unknown and the factors or molecules, which could modulate the
signaling pathways involved in the deleterious effects induced by BMAA have not been
established. In this regard, it has recently been proposed that the activation of Retinoid
X Receptors (RXR) can protect neurons and modulate the inflammatory responses
during neurodegenerative diseases of the central nervous system, including
retinopathies. However, the possible protective roles of RXRs in BMAA-induced
damages are still unknown. In this Thesis, we have studied the mechanisms involved in
the degenerative changes induced by BMAA into retinal cells, and in neuron-like,
differentiated rat pheochromocytoma cells (PC12 cells), as well. We also evaluated the
protection of RXR agonists against the deleterious effects of BMAA in retinal cells.
For these purposes, we obtained pure neuronal cultures of amacrine neurons and
photoreceptors (PHRs); pure MGC cultures, and mixed neuro-glial cultures from
newborn rats. In addition, we used PC12 cells and ARPE-19 epithelial cell lines. We
treated them with BMAA to evaluate its effects on these cells and the possible protective
roles of RXRs.
Our results showed that low concentrations of BMAA (0.4 μM) altered, not only the
viability of amacrine neurons and PHRs, but also that of neuronally differentiated PC12
cells, MGC and even that of the RPE cells.
Also, the cyanotoxin induced alterations in mitochondrial membrane permeability and in
ROS production, while in MGC, BMAA induced changes in the nuclear morphology. On
the other hand, in amacrine neurons, this toxin promoted axonal growth, although
simultaneously generating the collapse of their growth cones.
We established that all these alterations were induced by activation of NMDA receptors
in the presence of HCO3
-
ions. Besides, in all these cell types, BMAA appeared to
incorporate into polypeptide chains replacing Ser, since supplementation of the culture
media with this amino acid prevented toxicity damages.
Regarding the protective roles of RXRs, our results showed that their activation blocked
the toxic effects induced by BMAA in amacrine neurons, PHRs, and RPE cells.
In summary, in this Thesis we present evidences that BMAA affected multiple subcellular
structures in retina cells and in PC12 cells differentiated into neurons.
These results suggest that the damaging effects induced by BMAA represent a potential
health risk, which could contribute to the development of retinopathies, along with other
neurodegenerative diseases. In addition, this work would indicate that RXR activation
can promote survival of amacrine PHRs and RPE cells.
Taken together, these findings provide new knowledge regarding the deleterious
mechanisms induced by BMAA, which could be useful for the development of future
effective therapies.
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Rol de las células gliales de Müller en la preservación de la supervivencia y funcionalidad de los fotorreceptores de retinaVolonté, Yanel Andrea 23 March 2018 (has links)
La Retinitis Pigmentaria (RP) y la Degeneración Macular Asociada a la Edad (AMD) son enfermedades neurodegenerativas de la retina que se caracterizan por la pérdida progresiva e irreversible de las neuronas fotorreceptoras (FR). Ambas enfermedades son incurables, conducen a la pérdida de visión y no cuentan con tratamientos efectivos. Una estrategia para lograr desarrollar una terapia más adecuada para estas enfermedades es la utilización de células madre que puedan restaurar los tejidos dañados. Sin embargo, regenerar la retina requiere resolver varios problemas poco explorados: uno de ellos es la escasa actividad regenerativa de las células gliales de Müller (CGM) de la retina que, si bien han sido propuestas como células madre, poseen una efectividad muy limitada en mamíferos y son ineficientes para recuperar los FR perdidos. Otro problema es la respuesta reactiva de las CGM, la cual ocurre luego de daños en la retina y genera una inflamación crónica local que afecta la supervivencia de las neuronas regeneradas. Al respecto, recientemente se ha propuesto que los receptores X para retinoideos (RXR) son moduladores de la respuesta inflamatoria que protegerían a las neuronas durante las enfermedades neurodegenerativas del SNC. Sin embargo, aún se conoce muy poco sobre su rol en la retina.
El estudio de estas enfermedades enfrenta dificultades éticas y prácticas, por lo que el uso de ratones rd1, un modelo animal de RP que presenta una mutación específica que causa la muerte por apoptosis de los FR, resulta extremadamente útil para investigar las causas de la escasa capacidad regenerativa de la retina. Con este objetivo utilizamos retinas enteras y cultivos primarios neuronales y de CGM de ratones control y rd1. También investigamos y comparamos la actividad proliferativa de las CGM y la expresión de diversos marcadores de células madre, así como la expresión de los RXR y su efectos sobre la supervivencia neuronal y reactividad glial ante el tratamiento con un agonista sintético de estos receptores.
Los resultados indicaron una disminución de los marcadores de célula madre de las CGM rd1. Notablemente, la expresión de uno de ellos, Nestina, pudo ser revertida al co-cultivar las CGM rd1 con neuronas control (wt), lo que sugiere una alteración en la comunicación neuro-glial. Además, el agonista sintético de los RXR, PA024, retrasó la muerte de los FR y disminuyó la reactividad glial en cultivos de retinas rd1.
En resumen, en esta tesis presentamos evidencia de que en las retinas rd1 existe una alteración en la comunicación neuro-glial que afectaría el potencial regenerativo y dispararía una respuesta reactiva en las CGM. Asimismo, hallamos que la reactividad de las CGM y la muerte de los FR en las retinas rd1 pudo ser disminuida mediante la utilización de un agonista de los RXR.
Estos resultados sugieren que el potencial regenerativo de las CGM dependería de su interacción con neuronas sanas; que durante los procesos neurodegenerativos de la retina este diálogo neuro-glial estaría afectado; y que los RXR regularían, en parte, los procesos inflamatorios y la supervivencia neuronal en la retina. Estos hallazgos podrían ser de utilidad para el desarrollo de una terapia efectiva de reemplazo celular. / Retinitis Pigmentosa (RP) and Age-related Macular Degeneration (AMD) are neurodegenerative diseases of the retina which are characterized by the progressive and irreversible loss of photoreceptor neurons (PRs). Both diseases are incurable, lead to loss of vision and lack effective treatment. A strategy to develop an adequate therapy involves the use of stem cells that are able to restore damaged tissue. However, retina regeneration requires solving many unexplored issues. One of them is poor regenerative activity of Müller glial cells (MGC) of the retina. Although these cells have been postulated as stem cells, they have limited effectiveness in mammals and are inefficient to recover lost PRs. Another issue is the reactive response of MGC, which occurs after damage to the retina and causes local chronic inflammation that affects the survival of regenerated neurons. In that regard, it has recently been claimed that retinoid X receptors (RXR) are inflammatory response modulators that could protect the neurons from neurodegenerative diseases of the central nervous system. However, little is known about the role they play in the retina.
Research into these diseases faces many ethical and practical challenges. Therefore, using rd1 mice, an animal model of RP with a very specific mutation which causes death by apoptosis of PRs, is extremely useful to study the causes of poor regenerative capacity of the retina. For this purpose, we have used whole retinas and primary neural and MGC cultures from control and rd1 mice. We have also studied and compared the proliferative activity of MGC and the expression of several stem cell markers, as well as the expression of RXR and their effect on neuronal survival and glial reactivity upon treatment with a synthetic agonist.
Results showed decreased rd1 MGC stem cell markers. Remarkably, the expression of one of these, Nestin, could be reverted by co-culturing of rd1 MGC with control neurons (wt), which suggests an alteration in neuroglial
communication. Furthermore, using the RXR synthetic agonist PA024 delayed death of PRs and decreased glial reactivity in rd1 retina cultures.
In sum, throughout this thesis we have presented evidence that in rd1 retinas there is an alteration in neuroglial communication which could affect the regenerative potential and trigger a reactive response of MGC. Additionally, we found that MGC reactivity and death of PRs in rd1 retinas could be reduced by means of a RXR agonist.
These results suggest that regenerative potential of MGC could depend on their interaction with healthy neurons, that neuroglial communication could be affected when neurodegenerative processes of the retina take place, and that RXR could partially regulate inflammatory processes and neuronal survival in the retina. These findings could prove useful for the development of an effective cellular replacement therapy.
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Regulación de la migración celular en la retina por ceramida-1-fosfatoVera, Marcela Sonia 14 March 2019 (has links)
Las enfermedades neurodegenerativas de la retina son la principal causa de
disfunción visual en el mundo desarrollado. En ellas se produce la degeneración y
muerte de las neuronas fotorreceptoras, originando una disminución o pérdida total de la
visión, en los casos más severos. Las células gliales de Müller (CGM), el principal tipo
de células gliales en la retina, y las células del epitelio pigmentario de la retina (EPR)
desempeñan un papel clave tanto en la prevención como en el progreso de estas
enfermedades. En condiciones fisiológicas las CGM y las células del EPR son las
encargadas del mantenimiento estructural, fisiológico y funcional de la retina. Ante
alteraciones fisiológicas o frente a daños de diferentes tipos, las CGM y las células del
EPR modifican levemente sus funciones a fin de restablecer las condiciones normales o
reparar los daños existentes. La proliferación y la migración se activan como parte de
una respuesta inespecífica, pero cuando el daño persiste por mecanismos aún
desconocidos estos procesos se descontrolan y exacerban, tornándose
contraproducentes. A su vez, la localización de estas células en lugares inadecuados
distorsiona severamente la estructura y función de la retina, contribuyendo al desarrollo
de la disfunción visual, particularmente en las patologías retinoproliferativas. Dilucidar
los mecanismos de regulación de la proliferación y la migración, como así también las
moléculas que intervienen, es clave para lograr un tratamiento integral de estas
enfermedades.
Los esfingolípidos bioactivos son moléculas señal que regulan una gran
cantidad de procesos biológicos como la supervivencia, proliferación, migración e
inflamación. Entre éstos, la ceramida-1-fosfato (C1P) es un esfingolípido que regula
numerosas funciones biológicas en diferentes tipos de células. La C1P es generada por
la acción de la ceramida quinasa (CerK), enzima encargada de sintetizar C1P a través de
la fosforilación de la ceramida (Cer). La actividad de CerK es clave para la señalización
celular mediada por C1P y está regulada por niveles bajos de Ca+2, fosforilación y
diversos estímulos. La C1P promueve la proliferación través de la activación de
diferentes vías de señalización intracelular y la inflamación mediante la unión y
activación de la fosfolipasa A2 citosólica (cPLA2), que interviene en la síntesis de
prostaglandinas. Para promover la migración, se ha propuesto que la C1P activa un
receptor extracelular específico (parcialmente identificado). Trabajos previos de nuestro
laboratorio demuestran que la esfingosina-1-fosfato (S1P), un esfingolípido bioactivo
muy relacionado a la C1P, promueve la migración de las CGM (Simón et al. 2015).
Dada la estrecha interacción metabólica y funcional entre los esfingolípidos, es de gran
interés establecer si la C1P, cuyas funciones son semejantes a las de S1P, interviene en
la regulación de los procesos que contribuyen a las patologías retinoproliferativas.
El objetivo de esta Tesis es investigar si la C1P y la CerK participan en la
migración y en la proliferación de las CGM y las células del EPR.
Mediante el ensayo de la herida y utilizando cultivos gliales puros de retina de
rata y la línea celular humana de EPR, ARPE-19 investigamos los posibles efectos de
C1P/CerK en la migración de estos dos tipos celulares. En estos ensayos de motilidad
celular, consideramos la reducción del ancho de la herida como un indicador de la
migración.
Al evaluar el efecto de C1P sobre la migración de las CGM, determinamos
que la C1P aumentó la migración a través de la reorganización del citoesqueleto de
actina y la formación de filopodios y lamelipodios. Mediante ensayos de incorporación
del nucleótido Bromo-deoxiuridina (BrdU) establecimos que la migración no
contribuyó al cierre de la herida. Luego investigamos las vías de señalización
involucradas en el efecto de C1P. La inhibición de las vías PI3K/Akt y JNK con
LY294002 y SP600125, respectivamente, disminuyó la migración glial, tanto en los
controles como en los cultivos tratados con C1P. Mediante ensayos de Western blot
comprobamos que el agregado de C1P aumentó los niveles de p-Akt, forma activa de la
Akt, respecto a los controles, confirmando la activación de la vía de la PI3K. Al inhibir
la vía de ERK / MAPK con el inhibidor U0126 disminuyó la migración promovida por
la C1P, pero no se alteró la migración en los controles. A continuación, evaluamos el
papel de la cPLA2, mediador de C1P en la inflamación, que es activada por su unión a
C1P. El tratamiento con ATK, un inhibidor de cPLA2, redujo notablemente la migración
glial en cultivos tratados con C1P, mientras que en los cultivos controles la migración
no fue alterada. Demostramos así que la C1P promueve la migración de las CGM
mediante la activación de cPLA2 y JNK, PI3K y ERK / MAPK. Además, el agregado
conjunto de C1P y S1P, evidenció que estos esfingolípidos tuvieron juntos el mismo
efecto promotor de la migración glial que cuando fueron suplementados por separado,
evidenciando una interrelación entre ellos en la regulación de los mecanismos que
activan río abajo.
Como la realización de la herida activó la migración celular, decidimos
evaluar si la síntesis endógena de C1P estaba involucrada en dicha migración. Para ello,
establecimos en primer término, mediante RT-PCR que las CGM expresaban CerK.
Incubando los cultivos gliales con NVP231, un inhibidor de la CerK, demostramos que
la síntesis endógena de C1P fue necesaria para la migración glial en los controles y para
la estimulación de la migración por C1P. Para descartar que la inhibición de la
motilidad reflejara una pérdida de viabilidad celular, evaluamos dicha viabilidad por
ensayo de MTT. Determinamos que el tratamiento de los cultivos gliales con NVP231
no alteró la viabilidad celular.
En las células del EPR el tratamiento con C1P aumentó la migración,
mediante la reorganización del citoesqueleto de actina y el desarrollo de extensos
lamelipodios. Al evaluar el rol de la síntesis endógena en la migración del EPR,
comprobamos que el tratamiento de los cultivos con NVP231 inhibió la formación de
lamelipodios y bloqueó la migración de las células epiteliales. Determinamos, mediante
el ensayo de MTT, que el tratamiento con NVP231 no alteró la viabilidad de las células
del EPR. La C1P y la S1P promovieron la migración de las células del EPR, pero
cuando los cultivos fueron tratados con NVP231 antes del agregado de estos
esfingolípidos, el aumento de la migración que promovían fue bloqueado. Estos
resultados demuestran que la síntesis endógena de C1P fue necesaria para la migración
promovida por C1P y S1P, evidenciando que la síntesis de C1P es clave en la
estimulación de la migración por estos dos esfingolípidos.
A continuación evaluamos el rol de C1P en la proliferación. Ensayos de incorporación
del nucleótido BrdU en cultivos no confluentes demostraron que el agregado de C1P no
alteró la proliferación ni en los cultivos gliales ni en los epiteliales. La inhibición de la
síntesis de C1P redujo la proliferación en las CGM, mientras que no alteró la tasa de
proliferación de los cultivos epiteliales, lo que sugiere que la C1P sería un mediador
necesario para la proliferación glial en el período activo de mitogénesis de estas células.
En conclusión, en este trabajo evidenciamos por primera vez que la C1P agregada
exógenamente como así también aquella sintetizada por CerK en el interior celular,
potenciaron la migración de las CGM y de las células del EPR. Demostramos también
que la síntesis de C1P fue necesaria para la proliferación glial. Considerando la
importancia del proceso de migración y proliferación en los dos tipos celulares de la
retina decisivos en la mayoría de las enfermedades retinianas, proponemos a C1P/CerK
como clave en el desarrollo y avance de las retinopatías proliferativas. / Retinal neurodegenerative diseases are the main cause of visual dysfunction in
the developed world. Their common feature is the degeneration and eventual death of
photoreceptors, which leads to visual impairment and eventual blindness in the most
severe cases. Müller Glial Cells (MGC) are the main type of retinal glia and along with
the Retinal Pigmented Epithelium (RPE) these cell types are two key factors in both the
prevention and progression of these diseases. Under physiological conditions, MGCs
and the RPE are in charge of the structural, physiological and functional maintenance of
the retina. When faced with physiological changes or different damages, they alter their
regular functions in order to either reestablish a proper environment or repair the
existing damages; however, if the damage persists, the long-term changes of their
aforementioned functions can be counterproductive and contribute to the development
of retinal neurodegenerative pathologies.
Proliferation and migration are activated as an unspecific response upon
different damages in order to repair them but, due to unknown mechanisms, these
processes finally provoke retina structural and functional loss, thus contributing to the
progression of the visual dysfunction. The elucidation of the regulatory mechanisms
involved in controlling migration and proliferation, including the molecules involved, is
crucial for developing an integral treatment of these diseases.
Bioactive sphingolipids are signaling molecules that regulate a wide array of
biological processes, such as survival, proliferation, migration and inflammation.
Among them, ceramide-1-phospate (C1P) is a sphingolipid generated by ceramide
kinase (CerK), the enzyme responsible of phosphorylating ceramide (Cer) molecules.
CerK activity has a central role in C1P-mediated cellular signaling, and is regulated by
low levels of Ca2+, phosphorylation and many other stimuli. C1P promotes proliferation
by activating several intracellular signaling pathways, as well as promoting
inflammation by coupling with and activating the cytosolic phospholipase A2 (cPLA2),
which participates in prostaglandin synthesis. Both for proliferation and migration, it
has been proposed that C1P activates a (partially identified) specific extracellular
receptor. Previous work from our group has shown that sphingosine-1-phospate (S1P),
which is metabolically closely related to C1P, promotes MGC migration (Simón et al.
2015). Due to the close interconversions and functions of sphingolipids, uncovering the
role of C1P in the processes involved in proliferative retinopathies is highly relevant.
The purpose of this thesis is to investigate whether C1P and CerK participate in
the regulation of migration and proliferation of MGC and RPE.
By using the scratch wound assay in pure rat glial cultures and the RPE cell line
ARPE-19, we assessed the effects of C1P/CerK in the migration of these two cell types.
In these cellular motility assays we considered the reduction on the wound width as a
positive indicator of cell migration.
When evaluating the effect of C1P on migration, we determined that C1P
enhanced migration by reorganizing the actin cytoskeleton and the formation of
filopodia and lamellipodia. By quantifying the uptake of Bromide-deoxyuridine (BrdU)
by MGC we determined that proliferation did not contribute to the reduction in the
scratch width. We also investigated the signaling pathways involved in this process.
Inhibition of PI3K/Akt and JNK pathways with the selective inhibitors LY294002 and
SP600125, respectively, showed a decrease in glial migration in both control and C1Ptreated
cultures. Western Blot assays showed that the addition of C1P increased the
levels of p-Akt (the active form of Akt) when compared to controls, therefore
confirming the activation of this pathway. Selective inhibition of the ERK/MAPK
pathway with U0126 showed a decrease in C1P-induced migration, but did not alter it in
control conditions. We also evaluated the role of cPLA2, a mediator of C1P in
inflammation, which is activated by C1P binding. Treatment with ATK, a selective
inhibitor of cPLA2, showed a substantial decrease in migration on C1P-treated cultures,
while there was no alteration of the migrating capabilities in control conditions.
We therefore showed that C1P is a promotor of MGC migration by activating cPLA2 as
well as the JNK, PI3K and ERK/MAPK pathways. In addition, the combined addition
of C1P and S1P showed that these sphingolipids had the same effect together than when
they were added separately, suggesting either a direct relation between them or with the
downstream mechanisms they trigger.
Since we determined a basal reduction in the scratch width in control conditions,
we evaluated whether the endogenous synthesis of C1P was involved in this migration.
Initially, we established by RT-PCR assays that CGM expressed CerK. By incubating
glial cultures with NVP231, a selective inhibitor of CerK, we showed that endogenous
C1P synthesis was necessary for glial migration under control conditions, and that when
this synthesis was inhibited addition of C1P did not restore cell migration. In order to
verify that NVP231 did not affect cell viability, we evaluated viability by the MTT
assay. We determined that treatment of glial cultures with NVP231 did not alter cell
viability.
On RPE cells, treatment with C1P increased cell migration by inducing actin
cytoskeleton reorganization and extensive development of lamellipodia. When
evaluating the role of the endogenous synthesis on RPE migration, we concluded that
treating cultures with NVP231 inhibited lamellipodia formation and blocked RPE
migration. We also determined that the viability of NVP231-treated RPE cells was not
altered. Both C1P and S1P promoted RPE cell migration, but treating the cultures with
NVP231 beforehand, abolished the migratory stimulus. These results show that
endogenous C1P synthesis is essential for C1P and S1P-promoted migration,
establishing that C1P synthesis is crucial to promote the migration of these two
sphingolipids.
Furthermore, we evaluated the possible role of C1P on cell proliferation. BrdU
uptake assays on non-confluent cultures showed that the addition of C1P did not alter
the proliferating capabilities on either MGC or RPE cultures. The inhibition of C1P
synthesis impaired proliferation of MGCs, but did not affect that of RPE cells,
suggesting that C1P might be a necessary mediator for glial proliferation in the active
mitogenic stage of these cells.
In this work we showed for the first time that both addition of C1P as well as the
endogenous C1P produced by CerK promote migration of MGC and RPE cells. We also
demonstrated that C1P synthesis is required for glial proliferation. Taking into
consideration the relevance of migration and proliferation of both cell types in the
development of most retinal diseases, we propose that C1P/CerK is instrumental in the
development and progression of proliferative retinopathies.
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